本期要点
●在单个样品上执行多种互补光谱成像技术的能力是有利的。
●寿命成像是光致发光和拉曼光谱的补充，因为它提供了关于样品微环境的信息。
●RMS1000共聚焦显微拉曼光谱仪能够在一个软件包中实现三种成像技术。
在共聚焦光谱仪中，将多种互补的光谱技术相结合以最大限度地提高单个样品产生的信息是有利的。两种广泛使用的共聚焦光谱技术是拉曼和光致发光（PL）成像，它们通过读取波长相关的光谱来提供样品的振动和电子能级信息。1这两种技术都可以在配备有连续波（CW）激光器和电荷耦合器件（CCD）检测器的共聚焦拉曼光谱仪上进行。
图1. Jablonski图显示了拉曼散射、荧光和磷光的能量跃迁和相对时间框架。
材料和方法
将两种具有不同化学结构和光学性质的光致发光稀土磷光体混合并沉积在氟化钙盘上进行光谱成像。使用RMS1000共聚焦拉曼光谱仪（图2）对两种磷光体的微粒进行拉曼、PL和PLIM测量。
图2. RMS1000共聚焦拉曼光谱仪配置示意图
暗场成像
使用暗场成像确定了含有两种磷光体微粒的区域，如图3所示。标记为磷光体1和磷光体2的颗粒在显微镜下是可见的，因为它们在白光照射下分别产生绿色和橙色PL。然后使用PL、PLIM和拉曼对包含两个颗粒的样品区域进行分析。
图3. 磷光体1和2的暗场成像
光致发光
用于分析样品的第一种光谱技术是光谱PL成像，如图4所示。PL光谱图像显示了磷光体1和2的光谱强度分析，其峰值发射波长分别为549nm和640nm。
图4. 磷光体1和2的（a）PL成像（b）PL光谱
PLIM
接下来，对样品进行PLIM成像。由于两个粒子产生具有不同发射带的PL光谱，因此选择两个带相交的波长（620nm）进行寿命测量。激发速率设置为10kHz，电子模块设置为记录MCS模式下的衰减。图5中的PLIM图像和相应的衰减表明，磷光体1和2的寿命分别约为1.1μs和0.7μs。因此，除了通过PL发射波长来区分样本外，RMS1000还可以用于通过寿命来区分样本。
图5. 磷光体1和2的（a）PLIM图像（b）衰减
拉曼
最后，为了通过两种磷光体的化学结构来区分它们，使用拉曼光谱对它们进行了成像，如图6所示。由于两种磷光体在549nm和640nm处表现出PL，因此选择785nm激光器来获取拉曼图像。这确保了所得光谱不含荧光背景。
图6. 磷光体1和2的（a）拉曼成像（b）光谱
图6中的拉曼成像和相应光谱表明，这两种磷光体表现出独特的振动光谱，因此具有不同的化学结构。磷光体1和2的图像是通过分析1020cm-1和540cm-1处的拉曼峰的强度来构建的。
结 论
使用RMS1000共聚焦显微拉曼光谱仪，依次使用光谱PL、PLIM和拉曼成像来全面表征和区分两种不同的磷光体微粒，图7。这些技术提供了互补信息，因此有助于获得样本的大量信息和全面的理解。
图7. 磷光体1和2的暗场、PL、PLIM、拉曼图像
参考文献
1. I. Pavić et al., Raman and Photoluminescence Spectroscopy with a Variable Spectral Resolution, Sensors (Basel), 2021, 21, 7951
2. R. Datta et al., Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications, J. Biomed. Opt., 2020, 25, 071203
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