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陪您一起过七夕~
说到“心肌再生”，你是不是又想到了两个词“心肌干细胞”，“学术造假”？不不不，此再生方法非彼再生方法，您且听 M 君细细道来。
M 君正经话：
来自美国德克萨斯大学西南医学中心的 Hesham A. Sadek 课题组在 Nature 上发表了题为 “A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes” 的文章，揭示了 Calcineurin-Hoxb13 轴调节哺乳动物心肌细胞生长。
IF=42.778
研究背景
1、心力衰竭影响全球 2600 多万人，心力衰竭的主要潜在原因是成年人心肌在受伤后无法自行修复。
2、哺乳动物的心脏在受伤后早期能够通过心肌细胞增殖实现再生。
■ 重要“人物” 介绍
Meis1：由 Meis1 基因表达。Meis1 是 TALE 家族中一种非 Hox 同源异型盒基因。Meis1 是细胞周期阻滞的关键调控因子，在胚胎心肌细胞发育中起重要作用。
Hoxb13：同源域转录因子，是前列腺上皮细胞分化的关键调节因子，与细胞周期的调控有关。
Calcineurin：钙调神经磷酸酶，细胞质中一种 Ca2+/CaM (钙调蛋白) 依赖性蛋白磷酸酶。当 Calcineurin 被钙激活时，通过其下游转录效应因子 NFAT (活化 T 细胞核因子) 介导肥厚反应，NFAT 直接被 Calcineurin 去磷酸化并发生核转位。
图 1. Calcineurin 在糖尿病动脉粥样硬化和心力衰竭中的作用通路[7]
早在 2013 年，Hesham A. Sadek 研究团队在 Nature 发表的文章中，就将 Meis1 鉴定为心肌细胞增殖的关键转录调节因子，并认为它是心脏再生的潜在治疗靶标。
M 君叨叨：悄悄告诉你，研究背景不重要，重要的是今天朋友圈秀恩爱的暴击（溜了溜了……）
摘要
1、Hoxb13 是再生心肌细胞中再生关键因子 Meis1 的辅助因子。
2、成年小鼠心脏 Meis1 和 Hoxb13 双敲后促进心肌细胞有丝分裂，使肌节处于松散状态，改善心肌梗死后左心室收缩功能。
3、Meis1 和 Hoxb13 协同调节心肌细胞成熟和细胞周期。
4、Calcineurin 使 Hoxb13 在 Serine 204 位点 (Hoxb13S204) 处去磷酸化，促进其核转运和细胞周期阻滞。
研究方法
■ 动物模型
条件性心肌细胞特异性 Hoxb13 基因敲除的 Hoxb13-KO 小鼠 (Myh6cre : Hoxb13fl/fl)；
Tamoxifen 诱导型心肌细胞特异性 Hoxb13 蛋白缺失的 Hoxb13-iKO 小鼠 (Myh6mERcremER Hoxb13fl/fl)；
心肌特异性 Myh6cre : Meis1-Hoxb13 双敲除的 DKO 小鼠；
条件性诱导 Meis1 和 Hoxb13蛋白 缺失的 DiKO 小鼠。■ 主要实验方法
免疫荧光染色；免疫印迹 (WB)；免疫共沉淀 (Co-IP)；染色质免疫共沉淀结合下一代测序 (ChIP-seq)；磁共振成像；经胸超声心动图检测；TUNEL 分析。
M 君叨叨：想知道 Meis1 如何作用，还需顺藤摸瓜！
实验结果
■ Hoxb13 与 Meis1 的关联
此前的研究中，Sadek 的研究团队已经发现 Hox 蛋白家族与 Meis1 有紧密联系。在这次的研究中，通过在心脏损伤后进行再修复的 7 天内 (P1-P7) 检测 Hoxb13 蛋白家族的表达发现，Hoxb13 是再生后心肌细胞中与 Meis1 相互作用的转录因子。
图 2. 再生后早期 Hoxb13 的表达与 Meis1 相关
【Postnatal day：再生后天数；
P1：Hyperplastic growth，增生性生长;
P7：Hypertrophic growth，肥厚性生长】
M 君叨叨：确认过眼神，Hoxb13 和 Meis1 绝对有不可告人的关系，惹！
■ Hoxb13 的遗传缺失
首先，研究团队通过 Hoxb13-KO 小鼠发现，短时间内 Hoxb13 的缺失诱导心肌细胞增殖。另外，在注射 Tamoxifen 后，成年 Hoxb13-iKO 小鼠心脏 Hoxb13 蛋白减少，心肌细胞横截面积 (CSA) 显著减小，单核心肌细胞的比例也显著增加，而双核和多核心肌细胞的比例显著下降。两种小鼠实验结果表明，心肌细胞特异性 Hoxb13 缺失足以诱导成年小鼠心肌有丝分裂。
图 3. Hoxb13 缺失诱导小鼠心肌细胞有丝分裂和左心室射血分数 (LVEF) 的下降
除此之外，成年 Hoxb13-KO 小鼠中诱导了心肌梗死 (MI)，发现 Hoxb13 的敲除可以防止 LVEF 的下降，但是左心室收缩功能并没有改善。总的来说，Hoxb13 的缺失可预防 MI 后收缩功能的逐步恶化，但不会引起实质性功能恢复。
M 君叨叨：想知道 TA 有多重要，还得失去才知道
■ Meis1 和 Hoxb13 蛋白共同缺失
Meis1-Hoxb13 的缺失，即 DKO 小鼠心脏中发现了心脏再生的一些特征，如心肌细胞肌小节分解，单核心肌细胞增加。并且观察到成年小鼠中心肌细胞的增殖也很活跃。他们再进行了进一步的研究，以评估 Meis1 和 Hoxb13 缺失对心肌肥大的影响，发现 DKO 心脏表现出运动诱发的生理性肥厚反应减弱。
图 4. DKO 小鼠心脏表现出
减弱运动诱发的生理性肥大反应
M 君叨叨：连 Meis1 和 Hoxb13 都携手而去了，让我看看谁还是左手牵右手？
■ DiKO 小鼠中的心脏再生
那么成年小鼠心脏中条件性诱导的 Meis1 和 Hoxb13 缺失是否能促进心肌细胞重新进入分裂周期呢？首先，观察发现 DiKO 小鼠的心脏体重比变大，注射 Tamoxifen 后，心肌细胞横截面积减少了约 30％，并且观察心肌细胞的数量与有丝分裂发现，Meis1-Hoxb13 特异性缺失会诱导成年小鼠心室心肌细胞增殖。
为了检测心肌细胞增殖水平增加是否有助于成年心脏的修复，对 DiKO 小鼠进行 MI 干预，结果表明，Meis1 和 Hoxb13 的缺失诱导心肌细胞增殖，可以改善 MI 后的左心室收缩功能。
图 5. DiKO 小鼠的左心室收缩功能改善
另外，Meis1 和 Hoxb13 的体内靶标鉴定发现了三组不同的基因：分别是同时靶标 Meis1 和 Hoxb13 的 272 个基因，1,647 个仅靶标 Meis1 的基因和 1,326 个仅靶标 Hoxb13 的基因。通路分析证明，Meis1 和 Hoxb13 协同调节心肌细胞的分化和细胞周期。
■ Calcineurin 调节 Hoxb13
蛋白免疫印迹 (WB)/免疫共沉淀 (Co-IP) 结果显示 (蛋白提取过程中别忘了使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂来保护它们哟，戳一戳，MCE 官网直接可申请蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂 Cocktail 试用装哦！)，与 Meis1 和 Hoxb13 相似，P7 时钙调神经磷酸酶的催化亚基 CnA 的蛋白水平升高，并且这三种蛋白相互作用。扫描 Calcineurin 对接基序结果表明，Calcineurin 与 Hoxb13 直接相互作用，并可能将它去磷酸化。进一步地，他们找到了作用位点 S204，Calcineurin 依赖性的 Hoxb13S204 去磷酸化作用促进了Hoxb13 的核转运，并促进了细胞周期的阻滞。
图 6. CnA 在 P7 天的表达量升高
■ Calcineurin 调控心肌细胞增殖
先前有报道表明，心肌细胞中 CnA 的过度表达会导致严重的病理性肥大。一致的，Sadek 研究团队也证明了强制表达激活的 Calcineurin 会导致心肌细胞增生过早转变为心肌细胞肥大，而抑制 Calcineurin 则延长了心肌细胞的增殖期。
图 7. CnA-Tg 心脏显示 LVEF 明显降低，
并伴有明显的疤痕
【CnA-Tg：Ppp3ca (编码 CnA) 基因持续活跃表达；Rcan1-Tg：Rcan1 (表达内源性 Calcineurin 抑制物) 基因持续活跃】
结论
研究确定了 Hoxb13 是心肌细胞分化和增殖的重要调节因子，证明了 Meis1 和 Hoxb13 协同调节心肌细胞成熟和细胞周期，并且发现了 Calcineurin 在调控中重要的作用，靶向 Calcineurin-Hoxb13 轴可能有助于治愈心脏损伤。
M 君叨叨：找到了靶点，靶向治疗还会远吗？
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Cocktail III
缩写：
TALE：Three amino acid loop extensionMeis1：Myeloid ecotrophic insertion site 1NFAT：Nuclear factor of activated T cellsCSA：Cardiomyocyte cross-sectional areaMI：Myocardial infarctionLVEF：Left-ventricle ejection fraction
原文阅读：Ngoc Uyen Nhi Nguyen, et al. A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes. Nature. 2020 Jun; 582(7811): 271-276.
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参考文献
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1. Ngoc Uyen Nhi Nguyen, et al. A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes. Nature. 2020 Jun; 582(7811): 271-276.
2. Shalini A. Muralidhar, et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature volume 497, pages249–253(2013).3. Satwat Hashmi, et al. Molecular switch model for cardiomyocyte proliferation. Cell Regen. 2019 Jun; 8(1): 12–20.4. Jiqiang Yao, et al. The Homeobox gene, HOXB13, Regulates a Mitotic Protein-Kinase Interaction Network in Metastatic Prostate Cancers. Sci Rep. 2019 Jul 4; 9(1): 9715.5. Hui-Bin Liu, et al. Calcineurin and electrical remodeling in pathologic cardiac hypertrophy. Trends Cardiovasc Med. 2010 Jul; 20(5): 148-53.6. Benjamin J Wilkins, et al. Calcium-calcineurin signaling in the regulation of cardiac hypertrophy. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Oct 1; 322(4): 1178-91.7. Manasi S Shah, et al. Molecular and Cellular Mechanisms of Cardiovascular Disorders in Diabetes. Circ Res. 2016 May 27; 118(11): 1808-29.
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