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GLP-1受体激动剂药物
GLP-1受体激动剂（Glucagon-Like Peptide 1 Receptor Agonist，GLP-1 RA）是以GLP-1受体为靶点的，可发挥与天然GLP-1相同的生物学作用的一类药物。在GLP-1RA药物研发历程中，首先与世人见面的并不是以天然GLP-1结构为基础的多肽。2005年，全球第一款经FDA批准上市的GLP-1RA药物为艾塞那肽，其以希拉毒蜥（Gila Monster）的毒液中发现的多肽Exendin-4为基础，改造而成。天然GLP-1多肽未能迅速应用于临床治疗，主要是因为其在人体内过短的半衰期，仅为1-3 min！
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GLP-1多肽结构
GLP-1相对分子质量为3298，含30个氨基酸，由人体17号染色体上的胰高血糖素原（proglucagon，PG）基因表达。GLP-1在人体内以多种形式存在，PG基因经翻译加工后，首先生成无活性的GLP-1（1-37位氨基酸），然后在前提蛋白转化酶的作用下，切除N端的6个氨基酸，形成具有生物活性的GLP-1（7-37位氨基酸），再经过肽基甘氨酸a单加氧酶和肽基酰胺乙醇酸裂解酶作用，C端酰胺化生成具有高度生物活性的GLP-1 NH2（7-37位氨基酸），为人体内GLP-1主要的活性形式。
活性 GLP-1 之所以在体内半衰期极短，主要是因为其能被广泛存在于多种组织及血液循环系统中的二肽基肽酶 4（DPP-4）切除 N 端 2 个氨基酸残基，成为截短型 GLP-1（9-37）或 GLP-1（9-36）-NH2，失去生理活性。DPP-4 在肠道上皮和内皮细胞中高度表达，肠 L 细胞分泌的大部分 GLP-1 在肠道远端毛细血管中已被 DPP-4 降解，仅约 25% 的活性 GLP-1 能到达肝脏，只有 10% ~ 15% 能在全身流通。然而即使研究人员对天然GLP-1的DPP-4切割位点进行氨基酸突变改进，改造后的GLP-1仍会因自身分子量过小，而快速被肾脏清除（肾小球滤过阈值60 000）。
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长效GLP-1受体激动剂的改造方法
GLP-1受体激动剂药物的长效化改造，主要基于两个方面：
通过分子结构改造，屏蔽DPP-4酶切位点，防止在体内被降解；
减弱或避免肾脏的清除作用，构建GLP-1受体激动剂多肽融合蛋白或融合肽，增加分子量。
能够增强多肽类药物的长效性的方法有很多，这里我们重点介绍以下两种方法：
01
改造分子结构
DPP-4酶具有特异性切除多肽N端的二肽残基能力，识别位点为X-Ala或X-Pro（X为任意氨基酸），天然GLP-1多肽N端序列为His-Ala，极易被识别并切除，并丧失活性。定向化突变GLP-1第二位氨基酸，可有效解决这一问题。已经上市的长效人源GLP-1类似药物如：阿必鲁肽（Albiglutide）和度拉鲁肽（Dulaglutide）将N端第二位氨基酸Ala突变为Gly，司美格鲁肽（Semaglutide）将N端第二位氨基酸Ala突变为非天然氨基酸Aib，都有效的屏蔽了DPP-4酶的酶切作用。
02
多肽与蛋白融合表达
即使降低了GLP-1类似药在人体内被DPP-4酶降解的速度，一些药物由于其分子量较小还是会很快被肾脏清除。于是一些研究者将GLP-1与白蛋白、抗体Fc片段、脂肪酸侧链、HSA和聚乙二醇等生物大分子链接从而降低了被肾脏清除的速度。
已经上市的长效GLP-1类似药如阿必鲁肽（Albiglutide）利用链接白蛋白延长半衰期，而利用链接Fc片段来延长半衰期最成功的案例则是礼来的度拉鲁肽（Dulaglutide），利拉鲁肽（Liraglutide）是将长链脂肪酸以脂酰基的形式连接到肽链上，进入血液后通过脂水两亲的特性与白蛋白结合从而延长半衰期。
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各种改造方式的GLP-1受体激动剂的纯化策略
01
连接抗体Fc片段的GLP-1类似药
多肽在连接到Fc片段上后成为Fc融合蛋白，此时分子量变得比较大，同时也更容易形成聚体影响药物的安全性和有效性，因此Fc融合蛋白的纯化除了其他杂质外还应重点关注聚体的去除，其纯化过程类似于抗体蛋白的纯化。
Fc融合蛋白纯化首选使用ProA亲和层析（SpreX ProA H60/D80）进行粗纯，由于其高特异性，经过一步亲和层析后样品纯度一般可以达到95%以上，剩余主要杂质是HCP和DNA和聚体等，随后再使用离子层析（Pocar Q、Pocar SP）或疏水层析进行进一步精纯去除HCP、DNA和电荷异质体等杂质，并控制聚体含量。
02
连接HSA片段的GLP-1类似药
HSA全称是人血清白蛋白（Human Serum Albumin），由于其能够和Cibacron Blue 3GA特异性结合，因此对于偶联了这种配基的GLP-1类似药，毫厘科技即将推出的SpreX Blue就是其粗纯时的首选，同时这种填料还能被用于激酶、脱氢酶、干扰素和血浆白蛋白等的纯化。经过粗纯后通常纯度并不能达到人用药的标准，还需要通过阴离子层析（Pocar Q、SpreX Q D30）或复合模式层析（SpreX MMA）等方法进一步去除HCP、DNA等微量杂质。
03
未偶联复杂配基或侧链的GLP-1类似药
一些GLP-1类似物只是对其部分氨基酸进行切割或修饰，并未偶联其他复杂基团，此时其纯化可以参照通常的多肽纯化方法。通过细胞培养表达得到的GLP-1类似物为了方便进行纯化通常会添加His标签，此时可以使用SpreX Ni Elite/Max进行镍离子亲和层析进行粗纯，同时毫厘科技还推出了SpreX Ni TED填料，使用TED配基螯合镍离子，能够更加耐受培养过程可能加入的EDTA和DTT等试剂助力您的纯化过程。经过一步镍离子亲和层析后还需要通过高分辨率的离子层析（SpreX SP D30、SpreX Q D30）、疏水或反相层析等多肽常用的纯化方法进一步精纯。
若表达过程未添加His标签也不用担心纯化过程，使用离子层析（SpreX Q、SpreX SP）进行一次粗纯，虽然在纯度和收率上不如镍离子亲和层析理想，后续使用复合模式层析（SpreX MMA、SpreX MMC)、疏水或反相层析进一步精纯也能得到纯度符合人用药标准的产品。
04
连接PEG、脂肪酸侧链的GLP-1类似药
这类GLP-1类似药连接的基团通常不是直接通过细胞表达的，而是在对培养得到的未添加基团的GLP-1类似药进行初步纯化后再通过化学反应进行连接基团的操作。其前期的纯化可以参照未偶联复杂配基或侧链的GLP-1类似药纯化方法并达到反应所需的纯度和浓度，随后再对反应的混合物进行纯化。
对于连接脂肪酸侧链的GLP-1类似药，其偶联基团后的杂质主要是未反应完全的底物、反应过程加入的其他溶剂以及副反应的杂质，纯化方法可以选择离子层析（SpreX Q、SpreX SP），或是利用脂肪酸侧链的疏水性进行疏水层析，若反应中使用了乙腈等有机溶剂则使用反相层析会更加方便。
进行PEG修饰的GLP-1类似物也是在细胞收获液初步纯化后再进行偶联操作，但是与偶联脂肪酸侧链的GLP-1类似物不同的是PEG属于亲水性基团，因此使用疏水或反相层析的纯化效果并不理想，应当首选离子层析（SpreX Q D30、SpreX SP D30）来去除未反应的底物以及其他杂质。
“总结
GLP-1由于其修饰和改造的形式多种多样，不可能存在一种通用的方法或路线能够很好的应用于各种GLP-1类似药的纯化，应当结合其结构特性优先选择SpreX ProA H60/D80进行ProA亲和层析、SpreX Ni Elite/Max进行Ni离子亲和层析或是SpreX Blue这些能够进行特异性比较强的结合方式进行粗纯，这会大大降低纯化工艺开发过程中的复杂程度并提升效率。同时灵活选择离子、疏水、反相或是疏水模式进行组合，以更高的效率纯化出符合质量要求的产品。
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毫厘科技致力于微流控生产型芯片开发，为生命科学微球材料提供高通量数字化生产平台，用于多种类型的纳微级别功能性微球和生物粒子的分选、制造与工业级连续生产，可兼容琼脂糖、无机材料、聚合物等不同材质及不同尺寸不同结构的特殊要求。
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