———— Create仪器快讯 /第231227期 ————
安捷伦BioTek共聚焦微孔板成像检测系统引入水镜和新型共聚焦转盘技术
安捷伦近日宣布在 BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像检测系统中引入水镜和新型共聚焦转盘技术。这些技术通过减少对活细胞样品的有害影响来提高组织和 3D 细胞球体等较厚样品的成像清晰度，从而改善图像质量和数据结果。
Cytation C10 作为一款经济实惠的高性能共聚焦显微镜系统，采用了高质量设备组件，包括 Hamamatsu（滨松）科学级 CMOS（sCMOS）相机、奥林巴斯物镜和激光照明。机载环境控制、宽场荧光、明场和相差光学模块进一步增强了系统的成像性能。此外，将其与 Agilent BioTek BioSpa 8 全自动培养箱集成，可实现高效的多板位活细胞分析。
在光学显微镜中，水镜技术是在物镜和样本之间自动注水并形成稳定持续的水层。与空气相比，水的折射率更高，能够有效地增加物镜的数值孔径，提高 Z 轴分辨率，从而获得更高的图像质量和更真实的细胞和组织三维模型。水镜技术还可减少曝光时间，从而降低传统方法在这些实验中通常会产生的光毒性作用，帮助越来越多的研究人员得以开展能直接反映生理生化水平变化的活细胞实验，此类实验与固定细胞实验大为不同。
转盘式共聚焦成像技术通过阻挡非焦平面的光到达图像传感器，从而改善显微成像质量。适用于深层组织成像的新型共聚焦转盘（DSD）现作为 Cytation C10 的全新选配件，能够帮助研究人员更清晰更深入地观察厚样品。通过 DSD 获得清晰且锐利的图像非常适合定量分析应用。
上图为使用标准 60 µm 转盘（左）和 60 µm DSD（右）采集的细胞球体 Z 轴切片图像。深层切片转盘让有厚度的生物样本内部细节清晰可见，适用于深层组织穿透的共聚焦转盘（DSD）减少了厚组织样本内的信号干扰，从而可以清晰地观察厚组织样本和细胞球体。从具有挑战的（厚）样本类型中获得更详细的数据。
微孔板内细胞固定和抗体染色自动化解决方案
以往，我们使用显微镜做荧光成像的时候，常常将样本放在载玻片上。但是随着样本量增加，细胞实验使用 96 孔和 384 孔微孔板逐渐成为趋势，这与高内涵（high-content analysis，HCA）分析不谋而合。
高内涵分析是一种高通量识别并分析由与细胞相互作用的物质所带来的细胞表型变化的方法。这些物质包括小分子、受体配体和 RNAi，它们可能引起——增加或减少特定蛋白质产生的表型变化、G 蛋白偶联受体（GPCR）的内化、核激素受体易位、细胞凋亡、蛋白质翻译后修饰的变化以及细胞形态的变化。虽然通过明场成像（透射光）可以观察一些细胞形态变化，但更多的形态学变化需要使用更有针对性的染色方案，比如抗体或者小分子荧光探针。
BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像检测系统支持高内涵成像与分析
无论使用何种抗体和荧光染料的组合，对于低背景的特异性染色，都需要一系列的试剂添加和清洗步骤来去除未结合的抗体或染料。
安捷伦 BioTek 406 FX 洗板分液系统是一个模块化的系统，具备分液和细胞清洗双重功能。406 FX 可以通过触控屏或者使用电脑上 LHC 软件进行控制和编程：
快速清洗 96/384 孔板，且无需更换洗头；
最多 4 个注射器泵和 2 个蠕动泵分液器的组合允许同时添加6种试剂；
蠕动泵结合 1μL 卡夹，允许用户最大限度的减少试剂制备量；
管路内的试剂可回收；
注射器泵支持快速批量分液。
406 FX 洗板分液系统
一台 406 FX 即可完成 96/384 孔板中制备细胞样品所需的试剂添加和清洗步骤。成角度分液头的独特设计，有效保护单层细胞不受加液和清洗影响。
北京协和医学院张金兰/蒋建东团队揭示灯盏乙素通过调控Pdk-Pdc轴及线粒体有氧糖代谢挽救线粒体损伤
线粒体功能障碍被认为是衰老、阿尔茨海默病（AD）和血管性痴呆（VAD）等的共同致病机制。然而，目前还没有发现特定的潜在分子可以通过调节线粒体代谢和修复线粒体损伤来治疗神经系统疾病。
灯盏乙素（SG）是来源于灯盏细辛中的一种黄酮类化合物，SG 已被证明具有广泛的心脑血管及神经变性保护药理活性。而线粒体是细胞的能量工厂，线粒体生物能缺陷及其导致的葡萄糖基础代谢降低是促进神经退行性病变等神经系统疾病的关键病理生理调节因子之一。神经细胞和脑组织的功能高度依赖线粒体功能，神经递质代谢与神经细胞的能量代谢密切相关，从能量代谢角度研究 SG 对线粒体及神经系统的保护作用具有重要意义。
近期北京协和医学院药物研究所/医药生物技术研究所张金兰教授/蒋建东院士团队在 Advanced Science（IF=15.1）上发表了题为“Scutellarin Rescued Mitochondrial Damage through Ameliorating Mitochondrial Glucose Oxidation via the Pdk-Pdc Axis”的研究，该研究首次发现了灯盏乙素靶向脑组织线粒体丙酮酸脱氢酶激酶-丙酮酸脱氢酶复合物轴（PDK-PDC）调控线粒体有氧代谢，能够挽救受损的线粒体，进而发挥神经细胞保护的作用。研究结果表明，改善线粒体生物能缺陷的活性成分对神经系统疾病的治疗具有重要价值。
首先基于活细胞能量代谢分析发现对线粒体有氧糖代谢有调控作用的活性物质
同时开展亚细胞水平线粒体蛋白组学、代谢组学和 13C 同位素标记代谢流示踪研究，明确活性物质调控的代谢物流向和通量，以及调控的代谢酶
进一步基于激酶活性分析、质谱分析和分子生物学实验确证蛋白-活性成分的结合作用及结合口袋，最终揭示灯盏乙素靶向脑组织线粒体、调控线粒体有氧代谢及挽救受损的线粒体，进而发挥神经细胞保护的作用机制
采用安捷伦 Seahorse XFe96 analyzer 进行活细胞能量代谢分析，活细胞能量代谢实时监测分析发现，SG 可同时增强糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）过程，来缓解线粒体损伤导致的葡萄糖代谢低下。
图 1. NaN3 诱导线粒体 OXPHOS 损伤和 SG 处理后实时 ECARs 和 OCRs 的评估。A）糖酵解应激试验结果。B）对照组、模型组和 SG 治疗组糖酵解和糖酵解能力的 ECARs。
提取大鼠脑组织中的线粒体进行非标记定量蛋白质组学研究，结果显示线粒体组间差异蛋白主要与线粒体电子呼吸链及其上游糖酵解和 TCA 循环途径密切相关。这表明 SG 可增强线粒体有氧呼吸及其上游途径，增加氢质子和电子供应，增强 OXPHOS 相关蛋白功能并最终降低线粒体损伤。
线粒体蛋白质组学揭示了 SG 对氧化磷酸化和能量代谢途径的调节作用。
基于上述研究结果，进一步采用安捷伦 1290UHPLC/6550Q-TOF 开展了代谢组学和代谢流研究，以验证 SG 对线粒体损伤期间生物能缺乏的调节作用。
代谢组学分析表明 SG 显著增加了 TCA 循环中富马酸和苹果酸的丰度，以及连接糖酵解和 TCA 循环的关键代谢物丙酮酸的丰度。
图 2. A：主成分分析（PCA）显示，对照组、模型组和 SG 组差异显著；B：27 种代谢物涉及的能量代谢相关途径分析
代谢流分析：对 SK-N-SH（人神经母细胞瘤细胞）细胞的糖酵解和三羧酸循环通路开展了 [13C6]-葡萄糖示踪分析。结果显示，SG 作用能显著逆转线粒体损伤下糖酵解过程中 [13C6]-葡萄糖-6-磷酸和 [13C3]-丙酮酸的丰度改变，而 [13C3]-乳酸丰度无显著差异，表明糖酵解增强并未通过乳酸代谢途径增加能量供应，而主要流向丙酮酸代谢。尤为重要的是，SG 显著增强了 [13C3]-丙酮酸到 [13C2]-乙酰辅酶 A 的代谢流量，从而增强了线粒体葡萄糖源的有氧呼吸。在 TCA 循环中，SG 显著逆转了 [13C4]-琥珀酸、[13C4]-富马酸和 [13C4]-苹果酸代谢流量。总之，作者发现 SG 通过 PDK-PDC 轴调节 [13C3]-丙酮酸到 [13C2]-乙酰辅酶 A 的流量是 SG 对抗线粒体 OXPHOS 损伤的关键点。
图 3. 13C MFA 和 western blotting 结果显示 SG 能够调节葡萄糖-丙酮酸 - TCA 循环过程相关的丙酮酸代谢
基于激酶活性评估结果，进一步结合分子对接、免疫共沉淀（co-IP）、限制性蛋白水解-质谱（Lip-MS）、药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）和细胞热转移分析（CETSA）等实验，作者得出结论，SG 与 PDK2 蛋白相互作用，并可能通过与 PDK2 的硫酰胺结合口袋（lipoamide-binding）结合来抑制其活性。
为验证 SG 通过调节 PDK-PDC 轴发挥线粒体保护和神经保护作用功能，作者构建了 shPDK2 SK-N-SH 细胞系（PDK2 基因敲低的 SK-N-SH 细胞系），发现 SG 以 PDK2 为靶标对叠氮钠（NaN3）诱导的线粒体膜电位损伤和线粒体有氧呼吸损伤发挥保护作用。此外，作者还通过蛋白质组学研究了 SG 对线粒体损伤引起细胞死亡的影响。差异蛋白在生物学过程分析中与多种凋亡过程有关。B 细胞淋巴瘤（Bcl-2）家族的一组蛋白质与脑缺血中神经元死亡的调节密切相关。Bcl-2 蛋白家族是线粒体外膜通透性的主要调节因子，在内在凋亡途径中发挥关键作用。细胞色素 c 被释放到胞质溶胶中，并通过细胞凋亡触发程序性细胞死亡。细胞色素 c 的释放及其介导的细胞凋亡由 Bcl-2 家族控制。
在本研究中，作者发现 SG 在不同浓度下显著降低了由线粒体损伤引起的对照组 SK-N-SH 细胞凋亡，但在 shPDK2 SK-N-SH 细胞中没有观察到这种现象。同时，蛋白免疫印迹实验证实了线粒体损伤和 SG 给药对 Bcl-2 蛋白、细胞色素 c 和其他凋亡相关蛋白的影响，表明 SG 通过靶向 PDK2 调节线粒体依赖性细胞凋亡。
综上，该研究探索了新的潜在治疗方法：基于 PDK-PDC 轴治疗大脑低灌注引起的神经损伤和认知障碍，并发现 SG 通过特异性靶向 PDK2 发挥线粒体保护和抗凋亡活性。
图 4. SG 调节 PDK-PDC 轴和线粒体葡萄糖氧化发挥线粒体保护和抗凋亡活性
本研究开展了靶向 PDK-PDC 轴调控线粒体能量代谢的活性成分发现和机制研究工作：
基于组织病理、线粒体形态、线粒体关键参数、活细胞能量代谢分析等发现对线粒体有氧糖代谢调控作用的活性物质灯盏乙素
同时开展线粒体蛋白组学、代谢组学和 13C 同位素标记代谢流研究，发现 SG 调控的代谢物通路和关键代谢物流量及其调控的代谢酶
然后基于激酶活性分析、质谱分析和分子生物学实验确证蛋白-小分子结合作用。通过以上研究发现了 SG 发挥神经保护的作用机制及靶点，即 SG 通过抑制 PDK2 增强 PDK-PDC 轴功能，促进了线粒体有氧糖代谢和线粒体膜电位，并进一步调节线粒体依赖性细胞凋亡发挥神经保护作用
本研究采用多组学、代谢流结合细胞能量代谢分析，同时与多种分子生物学实验交叉验证揭示了灯盏乙素通过调控 Pdk-Pdc 轴及线粒体有氧糖代谢挽救线粒体损伤的机制，为基于线粒体 PDK2 靶标的神经保护作用药物开发提供了新策略。
* 张金兰研究员和蒋建东院士为该论文的共同通讯作者；生宁副研究员、博士研究生张智慧与郑浩是该论文的共同第一作者。
参考文献：
[1] Sheng N, Zhang Z, Zheng H, Ma C, Li M, Wang Z, Wang L, Jiang J, Zhang J. Scutellarin Rescued Mitochondrial Damage through Ameliorating Mitochondrial Glucose Oxidation via the Pdk-Pdc Axis. Adv Sci. 2023 Sep 26:e2303584.
单细胞的代谢分析 - SCENITH：基于流式细胞仪的单细胞能量代谢功能曲线绘制方法
单细胞的代谢分析
能量代谢重编程对癌症和免疫反应至关重要。肿瘤微环境中的葡萄糖竞争可以调节肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的代谢和功能，影响癌症的进展和抗肿瘤免疫反应。因此，随着免疫疗法的发展，亟需一种针对复杂组织/血液样本的简单免疫代谢谱分析方法，以便在治疗前后对患者进行监测，并预测免疫疗法的预后。
目前，安捷伦Seahorse能量代谢分析仪已成为活细胞代谢分析的金标准，以简便灵敏的方法分析细胞群整体代谢能力。而对于复杂的血液样本或者活检组织中的异质细胞或者极少量的细胞群的代谢谱的检测，细胞分选和培养基培养会改变细胞代谢活性，因此很难准确检测人体血液样本或活检组织中的异质和稀少细胞群的代谢谱检测。
法国Aix Marseille大学的Rafael J. Argüello团队开发了一种利用流式细胞术在单细胞水平上量化细胞代谢的方法SCENITH（single cell energetic metabolism by profiling translation inhibition），并将此方法应用于全血和人肿瘤样本中，确定了肿瘤组织相关免疫细胞与癌旁组织免疫细胞之间的代谢差异。
SCENITH实验设计原理
因此，可以通过测定 PS 水平来衡量整体的细胞能量代谢水平。科学家利用嘌呤霉素（Puromycin, puro）这种药物的特点，puro可以掺入蛋白质翻译过程，并导致蛋白质翻译终止，而带有puro的多肽会从核糖体中释放出来，结合新型抗 puro 单克隆抗体，便开发出了以 PS 水平为读数、具有单细胞分辨率的复杂代谢分析的简便方法SCENITH（图1）。
作者利用代谢抑制剂（2-DG和Oligomycin）证明细胞内ATP和PS水平相关性很高（r=0.985; p < 0.0001）。作为平行对照，分别利用Seahorse和SCENITH检测人活化T细胞的代谢特征，两种方法计算出的T细胞酵解容量结果趋势一致，且相关性高（Spearman r2 = 0.85, p < 0.01）。
图1. SCENITH 实验设计
SCENITH设计用于进行体内外代谢研究，尤其是针对全血/组织样本中的稀有细胞，避免了培养基带来的代谢偏差。作者也对来自患者实体瘤中的髓系细胞进行了SCENITH分析，发现了不同的代谢特征，其中癌旁组织巨噬细胞较肿瘤相关巨噬细胞具有更高的糖酵解能力，而肿瘤相关巨噬细胞糖酵解能力的下降与免疫抑制相关，也与肿瘤进展和预后不良有关。
接下来作者将SCENITH与单细胞转录组分析相结合。发现SCENITH获得的功能性代谢谱和单细胞转录组获得代谢基因相关表达谱高度相关，结果表明肿瘤微环境通过持久影响代谢基因的表达来调控巨噬细胞代谢水平（图5）。
图 5. 肿瘤和癌旁组织样本中并行进行 SCENITH 和 scRNA 测序代谢图谱检测
SCENITH 是一种用于复杂免疫代谢谱分析的简单方法。它允许用户同时建立表型，并在体外平行提取多种细胞类型的全局代谢谱。这种快速灵敏的方法与Seahorse技术具有一致性和可比性，因此可以作为Seahorse在全血/组织等稀有临床样品的代谢谱补充检测法。另外，大多数研究机构和医院都有流式细胞仪，因此SCENITH 是一种便捷以及低成本的能量代谢检测方法。SCENITH 还具有灵敏度高、易操作、单细胞分辨率高、只需一个荧光通道、读数稳定、操作时间短、与固定和分选兼容等优点，因此是研究组织细胞和体内复杂群体的整体代谢的无与伦比的方法。
SCENITH 是一种用于体内外复杂代谢分析样本的简单方法
SCENITH 可监测代谢途径受抑制时蛋白质翻译的快速变化
蛋白的翻译抑制谱反应了代谢容量和代谢依赖
SCENITH 可同时对血液和肿瘤组织样本中不同丰度的细胞进行代谢分析
科瑞恩特（北京）科技有限公司成立于2012年，总部设立在北京市经济技术开发区经海三路109号天骥智谷园区，毗邻京东，京东方，Corning，GE，Bayer等世界五百强科技企业中国研发中心。
科瑞恩特公司是一家基于前沿生物成像（质谱成像、动植物活体成像、细胞成像）、国产化替代高端设备研发等综合解决方案的实验室仪器设备和服务供应商，服务于生命科学、疾病控制、生物安全、食药健康等领域。无论是科研实验室、临床研究中心，还是企业研发基地，我们都能够提供专业的实验室综合解决方案，协助客户实现科研产出和成果转化目标。
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