双光子成像
双光子显微是一种成像技术，其中两个红外光子被同时吸收以产生更短波长的荧光。双光子吸收是一个非线性过程，其吸收概率与激发强度成二次方关系。这导致荧光被限制在比单光子荧光显微镜小得多的焦点，因为焦点是空间中唯一具有足够光子密度以发生双光子吸收的点。这种局部激发与较长波长红外激发光的较低吸收和散射相结合，使双光子显微镜成为深入厚生物样品成像的理想选择。
图1 单光子 vs 双光子激发
实验配置
双光子吸收需要非常高的激发强度，这只能通过飞秒激光器来实现。爱丁堡仪器 RMS1000 共聚焦拉曼显微镜具有外部激光耦合端口，可将飞秒激光耦合到显微镜中。下面显示了使用 RMS1000 进行双光子光谱和寿命显微镜的实验设置，其中 RMS1000 已配置有 CCD 相机和光子计数的光电探测器以及时间相关单光子计数 (TCSPC) 电子设备，用于光谱和寿命双光子显微成像中。
图2 双光子显微镜的光学设置示例。RMS1000 配备用于荧光光谱采集的 BI-CCD 相机和用于荧光寿命采集的光电探测器和 TCSPC 寿命电子设备。激发光源是 Chromacity 1040 HP 飞秒光纤激光器，工作频率为 80 MHz（Chromacity Ltd.，UK）。
RMS1000双光子成像案例
肾组织切片
图3 小鼠肾脏切片的双光子光谱强度 (a) 和寿命 (b) 成像
肠道组织切片
图4 使用 Alexa Fluor® 568 染色的小鼠肠道切片的双光子光谱强度(a) 和寿命 (b) 成像
铃兰草根茎
图5 用吖啶橙染色的铃兰草根茎的双光子光谱强度 (a) 和寿命 (b) 成像。
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