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外泌体研究：
    外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡（30-150nm），现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

服务内容：

1）外泌体分离提取，包括血清、细胞培养上清、尿液等

2）外泌体鉴定，包括透射电镜、NTA、流式细胞术、Western blot等

3）外泌体基因、蛋白检测分析技术（mRNA、miRNA、lncRNA、protein等）

4）细胞功能以及动物实验验证外泌体的功能

5）结合miRNA、lncRNA、功能蛋白等的研究方法检测外泌体的生物学功能以及作用机制

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外泌体综合研究方案：
外泌体（Exosome）形成是由细胞膜内陷，形成内体，再形成多泡体，最后分泌到胞外。外泌体中携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，而非编码RNA（包括miRNA、lncRNA、circRNA等）在调控基因表达等方面有着重要作用，对外泌体中的miRNA、lncRNA、circRNA进行研究不仅能够深入了解疾病或不同发育阶段的内在机制，而且筛选外泌体特异biomarker也有着非常高的临床应用价值。随着液态活检及体外诊断技术的不断发展，外泌体正在成为最新的疾病诊断标志物。

1.外泌体与lncRNA研究案例

     案例：Takahashi KJ, Yan IK, Wood J, et al. Involvement of Extracellular Vesicle Long Noncoding RNA (linc-VLDLR) in Tumor Cell Responses to Chemotherapy. Mol Cancer Res. 2014 ,12(10): 1377–87. 

      研究人员通过对细胞间对话媒介外泌体中的lncRNA进行研究，在肝癌中发现了一个独特的化疗药物应答及耐药性产生的机制。通过外泌体运转Linc-VLDLR到受体肿瘤细胞，使受体肿瘤细胞中Linc-VLDLR升高，进而通过调控下游变化使得机体产生耐药性。


研究思路：
      通过芯片筛选发现lnc-VLDLR在HCC细胞外泌体比HCC细胞更富集。敲降Linc-VLDLR后细胞增殖marker PCNA表达下降，增殖能力下降。化疗药物处理Linc-VLDLR表达变化。加入不同浓度的外泌体,Linc-VLDLR的表达随外泌体浓度增加而升高，敲降细胞中并没有升高。 细胞实验结果与此相符。化疗药物处理后，加入外泌体增加细胞活性，但敲降细胞的活性却没有增加。这说明外泌体能够在化疗药物处理后通过运转Linc-VLDLR调控细胞活性，并且可能是通过ABC转运蛋白家族。


2.外泌体与circRNA研究案例

      案例：Li Y, Zheng QP, Bao CY, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 2015, 25(8):981-4.
      circular RNAs是一类广泛存在的环状闭合的非编码RNA，可在体内调控基因的表达。外泌体是一类由细胞分泌的膜状囊泡结构，其内部含有丰富的物质，包括miRNAs, lncRNA,和circRNAs。外泌体中是否能检测到稳定存在的circRNA，能否作为疾病诊断的biomarker，该研究通过一系列实验进行了探索。证明CircRNAs在外泌体中是表达丰富和稳定的，可以作为肿瘤检测的潜在biomarker。

研究思路： 
该研究首先对肝癌细胞系分离外泌体进行了circRNA检测，表明细胞分泌外泌体中存在着丰富的circRNAs。随后对健康人血清来源外泌体进行了检测，表明血清外泌体中稳定的circRNAs是可能作为诊断biomarker。进一步的小鼠肿瘤模型和临床直肠癌病人样本血清外泌体的circRNAs检测表明，检测血清外泌体中的circRNA作为临床诊断的biomarker是可行的。

3.外泌体与miRNA 
      案例1：Melo SA, Sugimoto H, O'Connell JT, et al. Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNA Biogenesis and Promote Tumorigenesis. Cancer Cell, 2014.
      这篇文章中研究者采用Affymetrix microRNA 4.0芯片通过比对乳腺癌细胞株及正常细胞株内外泌体中microRNA的种类及含量发现两者的表达谱系差异，并进一步发现外泌体内含有microRNA加工系统，能够将前体microRNA加工为成熟microRNA，继而研究者对外泌体内加工前体microRNA为成熟microRNA的各组分分别进行了研究，证实外泌体内有着成熟microRNA加工这一机制的存在。从癌细胞分泌的外泌体到达远端后可以将其内加工成熟的microRNA释放出来并使正常细胞转化为癌变细胞，这一研究进一步揭示了癌症演变中外泌体的作用并为Dicer成为潜在的肿瘤标志物提供了线索。

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外泌体提取：

外泌体的提取方法有多种：包括传统的差速离心、密度梯度离心，以及后来发展的超滤法、聚合物沉淀法、免疫分离、隔离筛选法、体积排阻色谱法等。这些方法各有利弊。

服务内容
莱德盟生物综合各个方法的利弊，在现有试剂盒基础上进行优化，优化的外泌体分离试剂盒可以安全、快速获得高纯度和高产量的外泌体。
 

外泌体分离技术	耗时短	操作简便	外泌体产量	外泌体纯度	外泌体完整性
差速离心法		√	√
密度梯度离心法				√	√
超滤法	√	√	√		√
聚合物沉淀法	√	√	√		√
试剂盒	√	√	√	√	√

样本量
血清：样本量>5ml（全血10ml）。血浆：样本量>5ml（全血10ml）。体液：样本量>20ml。细胞培养上清液：样本量>20ml。

样本保存及运送
含外泌体的样本应低温保存；短时间（一般1周以内）可放4℃，长时间可放-20℃或者-80℃，并避免反复冻融。

外泌体鉴定
据国际细胞外囊泡学会（ISEV）在2014年的提议，外泌体鉴定分为三个层面：透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、Nanosight粒径、蛋白标志物。

服务内容
莱德盟生物技术团队拥有丰富的外泌体鉴定经验，可提供外泌体透射电镜鉴定结果、精准的外泌体粒径分析、外泌体表面标志物表达鉴定。

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TEM鉴定外泌体大小、形态
透射电镜分辨率为0.1~0.2nm，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，可观测样本中是否存在外泌体样结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球形），同时可测量外泌体大小。

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外泌体标志物测定
外泌体表面存在特异性标志物分子，如CD9、CD81、CD63等。以琳生物可以提供Western blot和流式细胞术的鉴定结果。


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广州莱德盟生物医学实验外包服务：
常规类：
AAV病毒包装、Westhern-blot、实时定量PCR、WB检测、细胞功能、ELISA、免疫组化、原位杂交、载体构建、慢病毒包装
特色类：
IncRNA功能研究方案、circRNA功能研究方案、microRNA功能研究方案、双萤光报告系统服务、CRISPR/cas9服务、动物实验、外泌体检测鉴定
其它：
标书制作、博士论文辅助与指导、论文润色