产品简介

混池测序是基于集群分离（Bulked Segregant Analysis，BSA）策略实现对目标性状的定位研究。在分离群体中，通过对发生性状分离的子代个体分别混成两个样本池进行测序，利用高性能计算平台和生物信息学方法，计算影响性状的候选区域以及相应的突变位置和突变类型，实现对目标性状的快速定位，加速作物育种改良。

  应用领域

  质量性状位点定位；

  QTL-seq定位数量性状位点；

  Mutmap定位诱变位点；

  产品优势

  性价比高：测序文库少，周期短，准确性高；

  分析全面：针对候选基因筛选进行详细的分析；

  丰富的物种经验：甘蔗、油菜、桃、水稻等。

  技术路线

内容分析

标准信息分析

  与参考基因组比对:比对率和覆盖度分析；

  SNP、InDel检测及注释:开发SNP、InDel标记；

  子代SNP、InDel频率差异分析:寻找有差异的SNP、InDel位点。

  高级信息分析

  目标性状区域定位:找到与目标性状关联的区域；

  候选基因提取和功能注释：获得候选基因及基因功能。

  样品要求

  1.样品类型：基因组DNA（混池测序）；

  2.样品需求量：单次2 ug；

  3.样品浓度：文库≥30 ng/μl；

  4.样品纯度：OD260/280为1.8-2.0；

  5.电泳要求：主带清晰，无降解或轻度降解。（距送样日最近的电泳结果）

案例分析

 1.木豆枯萎病和不育花叶病BSA研究

  本研究为了定位木豆枯萎病和不育花叶病基因，采用了集群分离分析（BSA）的测序方法。利用木豆基因组草图计算抗、感池的SNP index，最终获得了7个木豆枯萎病和不育花叶病的候选SNPs位点。同时另外增加了4个其他基因型的木豆进行重测序，与BSA结果一起统计，一共检测到8362个非同义突变SNPs。在这8362个SNPs中，有60个SNPs位点在BSA检测到的7个候选SNPs的侧翼2Mb的范围内。单体型分析结果将范围缩小到7个基因的8个非同义突变SNPs内。这8个候选SNPs进一步在抗、感不同的11个基因型木豆中进行重测序的结果验证。这些分析获得了与抗枯萎病相关的4个基因中的4个候选非同义突变SNPs，以及抗不育花叶病3个基因中的4个候选非同义突变SNPs。进一步的蛋白注释和表达的分析最终确定两个最后可能的候选基因，抗不育花叶病基因C.cajan_01839和抗枯萎病基因C.cajan_03203。

全基因组范围内SNP index分析获得的候选位点

BSA与非同义突变SNP联合分析

候选基因的qRT-PCR验证

  2.鹰嘴豆百粒重及根/总物质干重的BSA研究

  极端的干旱条件是一种主要限制鹰嘴豆产量的因素。两个响应产量下降的因素包括种子大小的缩小和根长/根密度。QTL-seq的策略就是用来鉴定百粒重以及在旱作条件下根干重和整个植株干重的比值（RTR）的候选遗传区间。对ICC 4958 x ICC 1882群体的极端性状混池的全基因组SNP位点的识别发现两个显着关联的遗传区间。其中百粒重QTL一个在CaLG01（1.08Mb）连锁群上，另一个在CaLG04 (2.7 Mb)连锁群上。同时在CaLG04 (2.7 Mb)连锁群上鉴定到一个和RTR相关的区间。综合分析后，最终共识别4个百粒重和5个 RTR QTL。随后两个百粒重基因（Ca_04364，Ca_04607）和一个RTR基因（Ca_04586）都进行了CAPS/dCAPS标记的验证。

在CaLG01和CaLG04连锁群上检测到的百粒重QTL遗传区间

在CaLG04连锁群上检测到的RTR QTL遗传区间

对两个亲本及极端性状混池进行标记开发的验证，同时又对不同的遗传群体的亲本进行验证

  参考文献

  1.Next-generation sequencing for identification of candidate genes forFusarium wilt and sterility mosaic disease in pigeonpea (Cajanus cajan)（Plant Biotechnology Journal, 2016, IF=6.090）

  2. QTL-seq for rapid identification of candidate genes for 100-seed weight and root/total plant dry weight ratio under rainfed conditions in chickpea（Plant Biotechnology Journal, 2016, IF=6.090）