几年前我在一次会议上发言，正在描述我们使用混合模式色谱以及它帮助我们解决的难题。当我描述使用混合模式色谱柱时需要考虑（并优化）的变量的数量和类型时，听众中会有嚎叫，这些抱怨主要集中在复杂性以及这些方法如何稳定，而我们已经有足够的变量来考虑，我们不需要更多的选择性等等。
亲水相互作用液相色谱（HILIC）不仅涉及亲水分配，还涉及氢键，离子交换（分析物或固定相），更多离子交换（盐添加剂或固定相），离子（电荷）排斥和离子排斥（置换）机制。而且，根据所使用的固定相，分区可能不是主要的保留机制。
我的观点？ HILIC不是直截了当的，可能存在一些需要考虑的方法。然而，当我最近在讲授我们关于使用各种不同的固定相的HILIC分离方面的工作时，没有人抱怨混合模式色谱法的复杂性。最新消息：HILIC至少在一些时候就是混合模式色谱分析！
我曾撰写了关于使用HILIC的一些实用技巧，我想扩展一些这些想法，尤其是在了解固定相的性质及其与分析物和流动相成分的相互作用时。如果没有对HILIC固定相和保留机制的基本了解，就很难理解这种类型的分离，出现问题时应该怎么做，或者如何开发和优化方法？
我们以一个简单的氨基固定相为例，考察HILIC分离中涉及氨基苯甲酸时可能发挥的一些相互作用。
图1：4-氨基苯甲酸在氨基固定相上HILIC保留的示意图。
从这个非常简单的固定相和分析物组合中获得的保留有很多可能的发现：
固定相的亲水性质将决定（除其它因素外）二氧化硅表面处吸附的水层的厚度。这转向将决定通过从洗脱液分配到用于更多极性（亲水）分析物和分析物部分（官能团）的富水层中的保留。
通过改变洗脱液中的有机物百分比可以影响该水层的厚度。
根据洗脱液的pH值，二氧化硅表面上的残留硅烷醇基团可能会带电（通常<pH4），因此可能在分析物阳离子基团之间发生离子交换。
如果分析物含有阴离子基团，则分析物和硅胶表面上带电荷的硅烷醇基团之间可能发生离子排斥，同样取决于洗脱液的pH值。类似地，如果分析物是阳离子的，则在键合相配体和分析物之间可能存在静电排斥。
如果硅烷醇基团或分析物不带电，则极性分析物官能团的存在可允许分析物与二氧化硅表面之间的氢键结合。此外，含有极性中性基团的键合相可以与中性极性分析物官能团形成氢键，并且这种类型的相互作用可以在HILIC分离中起主要作用。
在所示的pH条件下，固定相带正电，分析物带负电-导致静电相互作用。
如果洗脱液含有盐（例如乙酸铵），则根据离子的类型和浓度，可以通过增加浓度或抗衡离子强度（Hofmeister系列内的位置）来克服分析物静电相互作用。
范德华相互作用也将在固定相的疏水部分和分析物之间起作用。
总而言之，通过这种简单的分析物/固定相组合，以下相互作用和相互作用机制将成为可能：
a）亲水分配
b）离子交换
c）离子排斥
d）氢键
e）离子排斥（取决于洗脱液缓冲液的性质和浓度）
f）分析物和固定相结合配体之间的范德华（疏水）相互作用
因此，混合模式（有些人可能会说多模式）分离正在发挥作用，如果所有可能的相互作用都不被理解和解释，那么HILIC模式下的保留和选择性将很难预测或使用实验变量产生影响。
这些相互作用的可能性和程度取决于几个实验变量，并将随着所选择的固定相的性质而变化。一些固定相只能进行一些潜在的相互作用，这将在后面更详细地解释。
首先，简要总结HILIC中的实验变量以及它们可能如何改变：
疏水分配-亲水分配到富水层的强度受所选固定相和洗脱液中有机物量的影响。较高的有机物将导致极性（亲水）分析物更强地分配到富水层中，因此保留将增加。洗脱盐（缓冲液）浓度也可能影响水层的厚度。
静电相互作用-将取决于电离的程度；
分析物（离子或非离子）
键合相（如果是离子化的）
二氧化硅表面（残留硅烷醇基团）
为了操纵使用pH的HILIC分离，我们需要知道溶液pH值和分析物pKa值，以便估计分析物的电荷程度。 特别重要的是要注意，在典型的HILIC分离的高度有机条件下，分析物pKa和溶液pH值将与文献值或仅测量水相的pH值不同。 可以采用一些非常近似的经验法则来帮助我们评估溶液的pH值和分析物电离度：
表I和II：对高度有机洗脱液中洗脱液pH和分析物pKa的调整
因此，在规划包含离子型分析物或解析色谱法的HILIC分离时，我们必须小心谨慎，根据洗脱液中乙腈的量，分析物pKa的文献值和目标洗脱液pH来调整我们对分析物电离程度的思考。
一些固定相被设计为在溶液中带有完全电荷（永久电离），而另一些（例如两性离子相）携带正电荷和负电荷以降低静电相互作用的强度，并且这些相携带较小的净负电荷或正电荷在键合相的末端基团上。我们将讨论各种固定相以及它们在下面的静电相互作用的能力，但是我们应该注意到，对于一些配体如五氟丙基（PFP）固定相，保留几乎完全由与分析物的静电相互作用的强度支配，涉及很少的亲水分配。
当然，当考虑分析物和键合相之间的静电相互作用时，我们不应该忘记分析物和键合相之间也可能存在排斥，其中两者都是阴离子或阳离子。这些排斥力将起到减少保留和改变离子型和非离子型分析物之间的选择性的作用。
二氧化硅表面的pKa约为4，所以增加洗脱液pH值至4以上会使二氧化硅表面变得越来越阴离子，因此在解释HILIC分离时也需要考虑静电吸引或排斥。
氢键合-极性分析物和固定相部分可能能够氢键合，以便根据氢键的程度增加保留并改变极性和低极性分析物之间分离的相对选择性。
图2：4羟基苯甲酸和4氨基苯甲酸（右）与两性离子固定相的相互作用
图2显示经历与两性离子固定相的静电和氢键相互作用的4-羟基氨基苯甲酸（左）。 4-氨基苯甲酸的氢键是不可能的，因此该分析物的保留时间可能会更短。 应该注意的是，两种分析物都将经历亲水分离和静电相互作用，因此氢键增加或减少的影响可能不明显。
分离极性中性分析物时，HILIC分离中氢键的影响可能至关重要。
离子排阻（使用缓冲液）-典型情况下，淋洗液系统中使用的盐类型和浓度将影响分析物和固定相之间的静电相互作用程度。对于一些分离，改变甲酸盐和乙酸盐体系之间的缓冲液可能对分离的选择性有深远的影响。类似地，缓冲液的浓度将衰减静电相互作用的程度，并且盐浓度在5mM和100mM之间是典型的。当静电保持机制发挥作用时，较高的缓冲盐浓度倾向于导致较短的保留时间。应该指出，研究缓冲液浓度影响的良好起点大约为20 mM，但如果使用含有95％有机物的洗脱液，缓冲液浓度应保持在15 mM以下以避免缓冲液沉淀。
同样重要的是要注意，盐的用量也会影响水层的厚度，因此在处理中性分析物时可能会影响保留。较高的缓冲液浓度可导致较浓的富含水层，因此中性分析物的保留时间较长。
让我们通过考虑一些更流行的固定相类型以及我们可以预期的相互作用和保留机制的类型来得出结论：
图3：两性离子固定相
这些阶段倾向于具有较厚的水层并且将经历静电相互作用。 由于每个配体上的正和负基团的1：1比率将稍微平衡，因此电荷倾向于相对较低，总电荷量由每一相上的末端基团决定（因此当磺酸基团终端时净负电荷 例如配体）。 电荷的总体范围不受溶液pH的影响，并且这通常可以简化分离的计划和解释，其中pH只影响任何离子化分析物的电离程度。
图4：氨基相
氨基相充电，电荷的程度可能受洗脱液pH的影响。 它们对酸性化合物特别具有保留性，但经常会因平衡时间延长而受到影响。 在处理醛类时应小心，因为可能存在与固定相形成席夫碱的可能性。
图5：酰胺相
在大多数商业阶段，烷基间隔物长度很短。这些阶段不可离子化，因此保留机制更容易理解。保留和选择性可以通过较低的盐浓度来控制。
图6：二醇和多元醇相
这些相是中性的并且倾向于具有较低的亲水性分配（更浅的水层）。氢键的程度对于这些阶段是至关重要的。
图7：二氧化硅相
尽管裸硅石在HILIC分离早期流行，但二氧化硅表面较不均匀，并且硅烷醇基团的pKa可根据金属离子含量和表面处理而变化。由于这些原因，现在可以使用专用键合相，裸硅石不太受欢迎。
五氟丙基（PFP）相
这些相几乎完全依靠分析物和固定相之间的静电相互作用的强度分离，而疏水性分配很少。
虽然有许多其他更专业的阶段可用，但上述处理涵盖了最流行的阶段类型，并给出了HILIC分离模式中可能的多种保留机制的风格。如果不能很好地理解固定相及其可能的相互作用，就很难解释或计划有效的HILIC分离。
更鹰眼的读者会注意到，我从上面的列表中省略了氰基阶段。根据我们的经验，即使在高有机物浓度下，它们缺乏氢键能力并且往往难以保持极性分析物，这使得它们不太有利于HILIC分离。
（本文由LCGC Tony Taylor博客编译）
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