实验试剂

磷酸盐缓冲液（PBS – NaCl; KH₂PO₄; Na₂HPO₄和蒸馏水）

HBSS

不完全和完全介质（小牛血清） Roswell Park Memorial Institute （RPMI）

肝素钠钠盐，zui低99.5％滴定度，SIGMA-ALDRICH®

Ⅱ型胶原酶（Sigma＃S-7900）

BSA（牛血清白蛋白）

Azida 2mM

实验设备

剪刀

钳子

培养皿

1.5，2.0，15和50mL试管

热孵化器（振荡器）

细胞培养离心机（Thermo Scientific multifuge X3R）

巴斯德吸管

实验步骤

1．除去结肠穿孔活检分离固有层细胞，在无菌培养皿中用不完全介质（RPMI）彻底清洗整个结肠清除粪便，将结肠片段转移到另一个含有10mL完整的介质的培养皿中，置于冰上。

2．用小镊子，手术剪除去结肠片段中的脂肪是细胞高效分离的关键步骤。

3．将样品放在无菌培养皿中缓慢搅拌10分钟，用巴斯德吸管取出上清液并弃掉，这个过程重复六次。

4．将组织碎片转移到含10mL培养液（DTT）的培养瓶中，37℃，震荡30分钟（120RPM），弃掉培养液，这一步持续30分钟。

5．加入10mL洗涤液，37℃（（HBSS/HEPES）震荡10分钟（120RPM），洗去组织碎片中的DTT。

6．关键的一步：从结肠组织中的除去胶原蛋白这个过程是必不可少的。

7．这一步后，组织碎片中加入10ml胶原酶溶液，37℃摇轻轻振动筛（120RPM）45分钟。

8．45分钟后吸取出胶原酶溶液上清，转移到 Falcon® 15mL试管中。在4℃离心上清10分钟（1400RPM），加入0.5μL完全介质重悬浮，置于冰上。所有这些步骤必须重复四次。

9．细胞放在一个 Falcon® 15mL试管中，加入9ml蒸馏水溶解红细胞，10秒后加入1mlPBS中和这一步。之后4℃离心10分钟后（1400RPM），用0.5μL完全培养基重悬浮颗粒。

10．使用 Neubauer相机分析10μL样本中细胞数量，细胞数量应校准到1×10⁷细胞/ ml。细胞可以阻断阴性利什曼犬血清，置于冰上至少20分钟。

11．利用台盼蓝染料（0.4% （wt/vol） in HBSS）鉴别细胞活力。这个反应是基于事实，除非膜损坏台盼蓝不与细胞相互作用。

12．稀释抗体浅标记ADS，胞内标记物在透化性缓冲溶液内。

13．将浓度1×10⁷个细胞/ mL细胞悬液（20μL）放于96孔U型底板（Limbro Biomedicals® 175, Aurora, OH, USA）在细胞表面加入抗体。

14．将96孔板冷藏15分钟，之后每孔加入150μL预冷的 PBS， 4ºC（1300RPM）离心10分钟，弃掉上清。加入2％的甲醛200μL固定细胞。

15．将细胞加入到流式细胞仪管（荧光激活细胞），避光储存在冰箱中。

16．移去上清液胞内标记物，加入150μL PBS-w， 4ºC1300RPM离心样品10分钟，再次移出上清液。新增的透化性缓冲液（150μL）；慢慢的混合样品，室温环境下保持10分钟。再次离心10分钟（4℃，1300RPM），除去上清液。

17．加入细胞内抗体包括亚类室温下孵育40分钟，加入透化性缓冲液（150μL），离心样品去除上清液。这个过程可以重复一次。

18．加入150μL PBS-W重悬细胞，离心去除上清液，加入200μL 2％的甲醛将细胞移至流式细胞仪管，避光储存于在冰箱中。

19．用流式细胞仪分析细胞。激光发光在488nm（FACSVantage®, Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA）。

20．评估结肠固有层细胞单核细胞表型的固有层细胞数量，两种不同的形式表达，一个给定的表型标记的细胞百分比（％），用细胞和亚型对照终止，具有双峰分布和几何平均荧光强度（MFI）。后者方法用单峰分布表型标记的半定量表达。平均荧光强度和频率的基础上，三色流式细胞仪优化用于狗结肠亚型单核细胞表型。分析细胞应侧重于亚群细胞的组成，这些细胞是：CD4，CD4FOXP3，CD8，CD11b，CD11c，TLR9，TLR2，CD14和甘露糖。这为比较狗利什曼病粘膜的各种临床状态提供了一个机会。