限制性内切核酸酶λ 噬菌体颗粒

EDTA乙醇甲酰胺NaClTETris-Cl

琼脂糖凝胶硼硅酸盐巴斯德吸管

一、材料

1. 缓冲液和溶液

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

甲酰胺，去离子

NaCl ( 5 mol/L)

TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)

Tris-Cl ( 2 mol/L，pH 8.5)

2. 酶和缓冲液

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

4. 专用设备

硼硅酸盐巴斯德吸管（密封）或 Shepherd 钩

5. 载体和菌株

λ 噬菌体颗粒

二、方法

1. 如果必要，按方案 11 步骤 1~4 所述将 CsCl 从噬菌体颗粒样品中除去。

2. 测定噬菌体颗粒样品的体积。

3. 加入 0.1 倍体积的 2 mol/L Tris ( pH 8.5)、0.05 倍体积的 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）和 1 倍体积的去离子甲酰胺，37℃ 温育 30 min。

在温育过程中，牛奶状的噬菌体颗粒悬浮液变清成透明溶液。

4. 加入 1 倍体积（等于步骤 3 中的终体积）的 H₂O 和 6 倍体积（每倍体积等于步骤 3 中的终体积）的乙醇。

5. 将 λ 噬菌体 DNA 沉淀黏附于封口的硼硅酸盐巴斯德吸管或 Shepherd 钩的末端，转移至含 70% 乙醇的微量离心管中。

6. 短暂离心（10 s ) 收集 DNA 沉淀。

避免长时间的离心，否则将使 DNA 太紧密而难以溶解。

7. 去上清，将离心管打开于实验台放置数分钟以便使乙酵挥发。加入 300 μl TE，通过拍离心管壁使潮湿的 DNA 沉淀重新溶解。尽量避免使用涡旋振荡。

8. 加入 6 μl 5 mol/L NaCl 和 750 μl 乙醇重新沉淀 DNA，收集沉淀，如步骤 6 和 7 所述重新溶解。

9. 采用适当大小的分子质量标准，经 0.7% 琼脂糖电泳分析未消化的或已用适当限制酶切割的部分 DNA（0.5 μg），检査噬菌体 DNA 的完整性。

10. 将噬菌体 DNA 于 4℃ 保存。