盐酸胍可在裂解细胞的同时快速抑制 RNA 酶的活性,本方法利用这特点来分离果蝇 RNA
试剂、试剂盒 | Northern 样品缓冲液lmol L 乙酸酚氯仿DEPC 处理的水GHCL 溶液无水乙醇 |
---|
实验步骤 | 一 材料与设备
1)Northern 样品缓冲液:2.2mol/L 甲醛,1mol/LMOPS,50% 甲酰胺
2)lmol/L 乙酸
3) 酚:氯仿(1:1)
4)DEPC 处理的水
5)GHCL 溶液:5mol/LDTT,7.5mol/L 盐酸胍,25 mmol/L 乙酸钠 (pH7.0) 0.5%N-月桂肌氨酸
6) 无水乙醇
二 操作方法
1) 把果蝇或果蝇胚胎放入装有 GHCL 溶液的 1.5 ml 离心管屮每只果蝇或 50〜100 个果蝇胚胎需 50ulGHCL 溶液,最多处理 20 只果蝇
2) 用小研杵快速匀浆样品
3) 匀浆液中加入等体积的酚:氯仿,振摇混合 . 4) 在微量离心机中以最大转速离心 2 min
5) 上层水相转移到一个新的小离心管中
6) 每 50ulGHCL 溶液加入 lmol/L 的乙酸和 25ul 无水乙醇,以沉淀 RNA
7) 于-20℃ 放置 3〜24 h。
8) 在微最离心机中以最大转速离心 5 min
9)小心去掉上清,再以最初所用的一半体积的 GHCL 溶液溶解沉淀最小体积为 (50ul),
10) 按第至第 9) 步的方法重新沉淀 RNA。
11) 若有必要,再按上述方法沉淀 RNA—次。
12) 在 RNA 沉淀中加入第一步所用的 GHCL 溶液体积的无水乙醇,混合。
13) 用微量离心机以最大转速离心 15mim。
14) 去掉乙醇,如有必要再用无水乙醇再洗一遍。
15)RNA 沉淀可在合适的缓冲液或无水乙醇屮保存。如果 RNA 用来作 Northern 印迹分析,最好用 Northern 样品缓冲液溶解。
收起 |
---|
注意事项 | 1) 如果需要非常纯净的 RNA,按第 6) 至第 9) 步的方法共沉淀 RNA 三次
2) 为了最大限度的降低 RNA 酶的作用,操作时要戴手套,并经常更换,所有溶液都需用 DEPC 处理过的水配制。 |
---|