核酸亲和柱的应用极大地促进了核酸结合调节蛋白特性的研究,这些蛋白质涉及基因表达、染色体修复和复制、基因重组等的调控。核酸结合蛋白可以结合单链 DNA、双链 DNA 或 RNA。DNA 结合蛋白结合 DNA 可以是序列特异的,也可以是非特异的。此外,含有特异寡核苷酸的亲和树脂能用于某些酶的分离,这些酶利用结构非常相似的辅酶,如 NAD 和 NADP。总之,核酸亲和柱在各种蛋白质的纯化和特性研究中是一个有用的工具。
步骤一 偶联寡核苷酸到溴化氰活化的 Sepharose 4B
实验方法原理 | DNA 偶联至溴化氰活化的 Sepharcse 4B 是通过它们本身的碱基实现的。从理论上讲,该方法也许干扰最佳结合序列的接近路径,但是这样一个简单的方法一直被广泛地成功应用。偶联效率的定量检测可经 A260 值测定评估,或者更精确地从偶联介质上水解核酸和进行磷酸盐测定。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 混悬 1.5 g CNBr-Sepharose 4B 在水中,室温静置 30 min 约可获得 5 ml 溶胀的胶。经烧结玻璃漏斗过滤,当水分滤尽而溶胀的胶仍是潮湿的时候,立即停止抽滤; 2. 胶在漏斗内,依次用 4℃,200 ml mmol/L HCl、200 ml 水和 200 ml 10 mmol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液清洗; 3. 将胶移入含 2 ml 10 mmol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液的 15 ml 试管内; 4. 加 50 ul 寡核苷酸到试管,约每 ml 胶需用 2nmol 寡核苷酸。室温下振摇 16 h; 5. 再移入烧结玻璃漏斗,抽滤除去液体; 6. 先后用 200 ml 水和 100 ml 1 mol/L,pH 8.0 乙醇胺-盐酸清洗; 7. 将胶移入聚丙烯试管,在 7 ml 1 mol/L,pH 8.0 乙醇胺-盐酸中混悬。室温下摇 4~6 h。该步骤灭活未偶联的活化的胶; 8. 在烧结漏斗中,依次用下述溶液洗胶。100 ml 10 mol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液;100 ml 1 mol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液;100 ml 1 mol/L KCl;100 ml H2O;100 ml 储存缓冲液(10 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,0.02% NaN3; 9. 4℃可储存一年。 展开 |