使用基因融合表达系统在大肠杆菌中表达外源基因已越来越受欢迎。其原因在很大程度上归因于融合系统能够产生大量的可溶性的融合蛋白。谷胱甘肽转移酶以及硫氧还蛋白均被证实能非常成功地生产正确折叠、有生物活性的蛋白质。其中每一种都备有方便的纯化方法，可将融合蛋白与细胞污染物分开。所产生的蛋白质适用于进行其生物学活性或（和）相互作用的研究。随着融合表达方法的普遍应用，将 N 端的携带蛋白部分从 C 端的目的蛋白中裂解出来的能力就显得更加重要。
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 准备两个小量预试验反应以确定最佳温育时间。 反应 1:20 μl 含有 1 μl 200μg /ml Xa 因子的 1 mg/ml 融合蛋白 反应 2:5 μl 不含 Xa 因子的 1 mg/ml 融合蛋白（模拟消化） 室温下反应。 2. 分别在 2、4、8 和 24 h 取出 5 μl 反应液，加 2 × SDS 样品缓冲液 5μl ，-20℃ 下冻存。 3. 在 24 h 时，将 5 μl 反应 2 （模拟消化）液与 5 μl 2 × SDS 样品缓冲液混合。 4. 将 5 μl 原始融合蛋白溶液与 5 μl 2 × SDS 样品缓冲液混合（未裂解对照）。 5. 将所有样品于沸水浴中加热 10 min，加样到 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，根据裂解程度确定适当的温育时间。如果仅出现明显的部分裂解，应增加酶的用量和（或）延长温育反应时间。如未发生裂解，则依据辅助方案进行。 6. 确定了适当的裂解条件后，将余下的融合蛋白样本按比例扩大反应，仅留小量的未裂解融合蛋白作对照用。以 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳监测裂解程度。 展开 |
| 注意事项 | 经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶纯化的融合蛋白，可在 PBS 缓冲液中进行 Xa 因子消化。或者将蛋白质溶解在 20 mmol/L Tris • Cl（pH 8.0）/ 1mmol/L CaCl2/ 100mmol/L NaCl 中。尽管大多数融合蛋白可保存于 4℃，但直至步骤 6，应将其保存在 10% 甘油中于 -70℃ 下储存。 |
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