上皮细胞类培养实验_胃上皮细胞培养实验

细胞

胰岛素转铁蛋白胶原酶

培养基离心机滤膜

一、培养条件的准备

1.  基础培养基

DME/F12（Sigma 产），加庆大霉素100 U/ml，pH7.4

2.  完全培养基

（1）在基础培养基中再附加相关促细胞生长因子和其它成分
 

胰岛素（Sigma 产） 5 μg/ml

转铁蛋白（Sigma 产） 10 μg/ml

新生牛脑提取物  10 μg/ml
 

（2）新生牛脑提取物制法

①取新生牛脑垂体110 g/mlHEPES缓冲液匀浆；

②10000 转，离心20 分钟，取上清；

③水中透析2 天，透析袋为#08667B（Fisher 产）；

④10000转，离心20 分钟，取上清；

⑤0.22 微米微孔滤膜滤过除菌，-70 ℃贮以备用。

3.  细胞外基质（ECM）
 

IN型胶原 8 μg/ml

纤粘连蛋白 10 μg/ml

层粘连蛋白 8 μg/ml

多聚赖氨酸 0.001 ％

酵母提取物（Sigma） 5 ％

将以上混合物用弯头吸管涂于塑料培养皿表面

4.  消化酶
 

I型胶原酶（Sigma） 0.5 ％（用DME配）

透明质酸酶（Sigma） 0.5 ％（用DME配）

二、培养程序

1.  取材

取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许；

2.  清洗

用含庆大霉素（400 μg/ml）和二性霉素（2 μg/ml的Hanks）液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1 mm³大小；

3.  消化

在I型胶原酶和透明质酸酶中，于37 ℃中消化80 分钟；

4.  离心

收集细胞悬液，800 转/分，离心后，Hanks液漂洗两次；

5.  接种

末次离心后加入含有1 %~2 %胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。

细胞接种后一般在16 小时内贴壁，细胞呈多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持2~3 周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。

一、讨论

胃上皮细胞培养中证明，多加血清并不能提高促细胞生长作用，是因血清中除含有促细胞生长的PDGF因子外，也含有TGF-β1。我们研究证明TGF-β1有抑制上皮细胞生长作用。但因完全培养基中含有较多促上皮生长因子，仍利于上皮细胞生长。上皮细胞生长对ECM有依赖性，其中以N型胶原对胃上皮细胞作用更好。