（一）基本概念 为了方便新人与老司机交流，需要掌握一些基本名词和概念，以便准确的表述问题。这些知识不考试，写作时间也有限，关键还没有稿费，所以随便写写，没有咬文嚼字，如果意思表达错了请指正，形式上就不用对着教科书抠字眼了，谢谢。 1.抗原、抗体，和二抗： 抗原（半抗原）：能够诱导产生抗体（免疫原性）并且和这个抗体特异性结合（抗原性）的物质，一般称为大分子物质。半抗原是只有抗原性，而不能诱导产生抗体的物质，称小分子物质，通常只有一个抗原决定簇。一般低于10KD免疫原性就很差了，但免疫原性与分子量没有绝对关系，还要看结构的。 抗体：能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白。单抗和多抗，单抗是针对一个抗原决定簇的，单一类型的抗体；多抗是针对同一免疫原（一个或多个抗原决定簇）的不同单抗的混合体。种类上又分IgG、IgM等，IgG又分不同亚型，1、2a、2b等。结构上是Y型，上面两个相同的可变区Fab与抗原特异性反应，恒定区Fc具有种属特异性。 二抗：以抗体（通常只是Fc片段）免疫另一物种产生的一种抗体，有多抗比如羊抗鼠IgG（Goat anti mouse IgG），是用鼠IgG的Fc片段免疫山羊，获得的一种多抗，不管你小鼠单抗是针对什么抗原的IgG（主要是Fab差异），其Fc基本是相同的，所以都能被羊抗鼠IgG结合，常用做C线，但是不同亚型的IgG的Fc段结构有差异（分型的基础），与二抗的结合效果可能存在区别。也有单抗如鼠抗人IgG、鼠抗人IgM，最常用的间接法（捕获法）的原料。 虽然我们常用羊抗鼠IgG做C线，但是请注意C线≠二抗，C线用什么就说什么最省事，不要把C线如何如何，说成二抗如何如何，这样会让大家误解你的检测模式设计。 2.检测模式：（如图，手机上看不到，试试电脑版浏览，如果还看不到就得留言联系管理员了） 1）夹心法：
2）间接法（固相包被抗原，标记抗人抗体）和捕获法（固相包被抗人抗体，标记抗原），其实我觉得没必要刻意纠结这两个名词，反正交流的时候，都免不了被问标记的什么，包被的什么。这两种方式相当于一个另类的夹心法，调整起来跟夹心法基本想同。
3）竞争法：一切与夹心法反着来。如下图，人为偏向标记抗体和待测抗原先反应，即正常的不公平竞争模式，有利于消线；还有标记抗原，NC包被抗体的，这样标记抗原和待测抗原在同一时间与T线抗体竞争结合，是一种公平竞争，灵敏度比前者要差很多。
4）标记抗原还有个搭桥法： 在制作重组抗原的时候，人为嵌入一段便签序列，这样做一方面有利于抗原纯化；另一方面可以简化并且高效标记。因为结构原因，抗原标记相比抗体标记，一是容易引起交联死金，不好顺利标记；二是容易掩盖活性位点，不能有效标记。这时候标签就能发挥很大作用了，比如你抗原有GST标签，你可以先在金子上标记抗GST抗体，然后再加进去抗原，形成“金--抗GST抗体--（GST标签）抗原”这种复合物，相当稳定，而且抗原远离金子不会形成空间位阻，并且你标记一个GST抗体，所有含GST标签的抗原都可以拿来搭桥。 3.空间位阻： 就是胶体金颗粒在空间上阻挡了抗体和抗原的接触和反应，说几个数据会比较形象：金子常用大小为40nm，IgG抗体一般分子量在160KDa左右，长度约8nm，并且因为抗体的结构原因，一般是Fc结合胶体金，Fab向外伸展，反应部位充分暴露，不存在空间位阻的问题。但是标记重组抗原就不同了，在金标上常用的重组抗原一般15-40Kd，换算过来相当于0.8-2nm左右，并且标记结合部位很随机，不像抗体那样天然的远离反应位点，所以标记时有两种情况会导至没有活性，一是直接标记在反应位点上，；二是标记位置非常靠近反应位点，虽然没有掩盖，但是因为金子的空间阻挡，抗体还是没法跟他反应。
4.一些文献常用词： 金标试纸条一般是两条线，质控线（C线，Control line），检测线（T线，Test line，这里的抗体一般称呼是coating / capture antibody），金结合垫（conjugate pad，这里的抗体一般叫labeling / detection antibody）。
5.蛋白等电点PI： 蛋白质（氨基酸）是一种两性电解质，既可以从羧基释放H+，从而带负电，也可以让氨基结合H+而带正电，到底带什么电荷取决于所处Ph环境，Ph等于等电点时整体电荷为0（等电点时单个氨基酸理论上有不带电荷的可能，但是由不同氨基酸组成的蛋白质，应该是带电荷的，只是所带正负电荷数相等），大于等电点时整体带负电（负电荷总数多于正电荷），小于等电点时整体带正电（正电荷总数多于负电荷）。 也就是说在任何Ph环境下，蛋白质都同时带正电荷和负电荷，电荷在标记过程中起着很重要的作用，一是其本身贡献结合作用力，另一个重要的影响是，标记的前提是蛋白和金在溶液中接触，而电荷直接影响两者的接触，也就是影响标记效率。还有一个隐藏的属性是，加入蛋白本身对标记Ph有一定的影响（释放或结合H+），而且其保存液也是一种缓冲液，这个隐藏属性对标记环境有一定的影响，尤其是放大标记过程。
6.结合的三种作用力： 1）电荷引力： 前面讲过，胶体金表面有一圈负电层，蛋白质在标记环境下有一些基团是带正电荷的，两者之间通过电荷引力结合。注意，蛋白虽然是通过正电荷与金结合，但是我们调节Ph的目的并不是刻意使蛋白带正电，如果一个蛋白带有很多正电基团，这些基团同时吸引结合多个胶体金，这些胶体金再去结合带正电的蛋白，再结合胶体金……，这样循环下去，就会形成交联死金的情况，表现就是低Ph条件标记，胶体金变紫、变蓝甚至变黑沉淀。相反我们的目的是使蛋白带合适的负电荷，不至于与胶体金无限交联，但是这个Ph也不能太高，太高了蛋白本身正电基团减少，蛋白与胶体金负电斥力增加，两者很难接触到一起，表现就是随着Ph的继续升高，标记物活性降低，（极端情况下，蛋白负电荷太多，与金完全相斥，不发生结合）。 因此Ph需要在一个合适的范围，有合适的负电基团保持与胶体金的斥力，维持稳定，同时有足够多的正电基团与胶体金吸引并结合，保证高的标记效率。 2）疏水作用力： 这种力在免疫反应中的作用最大最强，对于维系复合物稳定起到主要作用，而胶体金与蛋白的稳定吸附也很依赖疏水作用力，如果说之前的电荷引力是相亲，第一眼的印象很重要（同性相斥，异性相吸），那么疏水作用力就是领证，维系稳定的婚姻关系（强力、长期），所以对于标记来说，除了Ph外，表活的存在也会严重影响标记效率，因此标记时不能加表活，烧金、标记的玻璃器皿也最好别用含表活的洗涤灵清洗。 早期论坛里有一种说法，说调Ph到等电点附近时，折叠在蛋白内部的疏水基团会暴露出来，增加与金的疏水结合。这个说法我没找到相关的文献支持，说说我的理解： 论坛这个说法可能是源于蛋白盐析和等电点沉淀法的原理，蛋白质一般在等电点时溶解度最低，在等电点外的Ph环境下，因为蛋白上面带同种电荷相斥和水化膜的保护，能够稳定溶解，但在等电点时蛋白的净电荷为0，斥力消失，蛋白容易碰撞到一起，因疏水残基互相结合而析出，如果再加入盐蓄意破坏水化膜，蛋白就稀里哗啦的沉淀了。但这些疏水基团并不是在等电点时才由内部露出来的，虽然蛋白的大部分疏水基团折叠在内部，但是仍然有疏水基暴露在水中（数量不一，多的据说有约1/3），也就是在等电点时，没有了斥力，蛋白表面的疏水残基容易发挥作用，而不是在等电点时才暴露出疏水基团。 从这里引出的另一点推论是，疏水作用力的发生需要疏水基团空间上足够靠近，如果有静电斥力存在，疏水基团碰不到一起，也就发挥不了作用了，这也就是说，标记时Ph过高导至活性降低的原因，一是正电基团减少，电荷引力减弱，另一个静电斥力太大，疏水作用力很难发挥作用，综合结果就是结合到金子上的蛋白更少了。 最后要说的是，蛋白的折叠结构确实会受Ph的影响，因为蛋白质的COO-和NH3+这两种残基之间会形成电荷引力，这是维持蛋白三维空间构象的一种作用力，不同的Ph条件，会改变蛋白的电离倾向，从而破坏这种作用力，使蛋白质的空间构象发生一定的改变。这种改变带来什么影响不好说，我们常用的Ph范围内，抗体构象改变的程度应该并不大。
3）金硫键：一个强大的作用力，以下引自涛哥的《桔林杂谈（3）—纠结的PI+0.5》。 “为什么我们在实际探索最佳标记PH的时候，有的蛋白最佳标记PH并不符合这个规律？有的蛋白随着标记PH的升高反而表现出更强的特异性反应，或者特异性反应强度出现抛物线样的变化，或者······ 我们在解释PI+0.5时，并没有引入配价结合参与标记过程的机理。蛋白的半胱氨酸残基可以通过硫基与胶体金表面形成配位键，而这种结合作用力是非常强的，完全可以打乱上述规律。比如一个蛋白的氨基酸序列中含有相对较多的半胱氨酸残基，而这些残基分布在序列的多个位置上，牢固的吸附于胶体金表面，这样蛋白的特异性表位可能很难暴露出来。如果采用较高的标记PH，当斥力占绝对优势时，蛋白特异性表位将会暴露出来。反应在表观上，就是在一定范围内，标记PH越高，特异性反应越强。如果一个蛋白含有非常多的半胱氨酸残基，由于强大的配位键结合力，将会导至金标记物互相吸附，进而凝集、蓝变甚至沉淀。这可以解释，为什么有的抗原纯度虽然很高，也不含有干扰成分，但即使采用很高的标记PH，也无法标记成功。将抗原加入胶体金溶液中，即发生蓝变。 另外一个典型的可以说明配位键对标记效果影响的例子是：硫柳汞，这也是胶体金产品中忌讳该防腐剂的原因。 此时，我们会发现配价结合作用力与其它作用力对标记效果的影响，有时候会产生矛盾，而互相矛盾的作用力共同作用一个反应的时候，可能会出现抛物线样的性能表象。在抛物线的前后位置，代表了某种作用力更占优势，而在抛物线的顶端，是各种作用力的平衡点。 在查阅文献资料的时候，我们还可能会看到一种说法，关于标记蛋白大致可以分为三类：PH非依赖型、PH非严格依赖型、PH严格依赖型。之所以有这种说法、出现这些现象，与三种作用力的共同作用有关。对于PH非依赖型和非严格依赖型往往与蛋白的氨基酸序列中含有相对较多的硫键有关。“ 未完待续…… |
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第二话——标记（中）
（二）操作
上面大篇幅都围绕Ph展开，因此不难想象Ph是标记优化的一个关键点，总结起来就4个字——高效、稳定。很多流程里，摸索最佳Ph都是优化标记的第一步，但是如果大家对第一话《烧金》的内容还有印象的话，那么标记的第一步首先应该是找到合适的容器，因为胶体金有洁癖。
1.容器：
推荐用清洗过的西林瓶（玻璃瓶）。因为两点原因，不推荐用ep管，一是不干净，你可以做个实验，拿十几个离心管，装好胶体金，其他什么都不加，用力摇晃，会发现金子颜色变化，严重的情况是金子直接变深紫、甚至变黑，轻微的情况是金子稍微偏紫一些，这是因为离心管不干净导至的死金，如果其随机发生在标记过程中，结果会难以分析。二是容易产生吸附，尤其是在用高倍金（比常用的1/万浓度高的金）标记重组抗原的时候。
万一你图省事，用离心管随便做做，至少要用超纯水多洗几次，包括与胶体金接触的枪头。说到枪，在少量标记时，如果用枪混匀，一定要慢吸慢放，快了的话，金子从枪头上行接触到枪末端，一个是对枪不好，再一个金子会死的很难看。
2.最适Ph：
1）取6个玻璃瓶，每个加1ml胶体金（1/万浓度，也可以做个10个8个的梯度）。
2）分别加入0.2M碳酸钾0、2、4、6、8、10ul，加入之后马上、充分混匀。（注意：加进去碳酸钾要马上混匀，不然的话，碳酸钾会自然沉降到底部，导至局部离子强度过大，严重的情况会导至底部的金子直接死掉，变成黑色，而上面的金子是正常的红色，出现明显的分层现象。）
3）分别加入10ug待标记原料，混匀，反应30min，观察颜色变化。（标记时间后续需要优化，分析颜色变化有利于了解原理和解决问题）
4）分别加入10%的BSA 100ul，混匀，反应30min。观察颜色变化。
5）离心，4℃，9000rpm，15min，上清尽量取干净。（机器不同，金子大小不同会有差异，具体根据离心效果看，上清干净即可。正常情况下，离心后沉淀蓬松，管壁无沉淀）
6）1/10体积复溶（注意复溶表现，有无不溶颗粒物），喷金6-9ul/cm，与划好的膜一起组装检测，符合性能要求的前提下（或者性能相差不太大的情况下），尽量选择远离变色临界点的条件为最适Ph。
3.讨论：
1）一个最佳Ph实验，需要一个完整的生产、检验过程，不要奢望看个颜色，加个NaCl就出结果了，想想我们优化Ph的初衷——稳定、高效，首先是获得一个稳定的标记物和稳定的生产过程，也就是从头到尾不死金，再一个就是产品的性能符合要求。
标记物再稳定，产品性能不合格，也是枉然；性能合格，操作重复性或产品稳定性差，也是白瞎。
我们来看一下NaCl滴定为什么不适用（NaCl滴定的原理在第一话中讲过，是基于盐离子对疏水胶体稳定性的破坏作用）。
首先，低标记ph下，蛋白会带更多的正电荷，金标物之间的斥力会比较小，但这时标记的效率较高，而高标记效率往往是我们追求性能时所需要的，这时我们如果加NaCl进去，会很破坏本就脆弱的斥力，进而出现死金现象，但是在正常操作时我们会用BSA进行封闭，这个封闭不仅能封闭金子表面，更重要的是，他使金标复合物带了更多的负电荷，使标记物更加稳定。所以，NaCl法没有考虑到封闭的稳定作用，NaCl滴定不稳定，不代表封闭后也不稳定；再一个，NaCl滴定会误导我们选择性能较低的条件（ph偏高一些），当然这也有一点好处，就是选择高的标记ph条件对放大生产的稳定有利。
上面这种情况是NaCl滴定能够得以顺利实施的情况下表现出的缺陷，在其他一些特殊情况下，NaCl滴定法可能没办法实施，比如，标记后的复合物本身斥力足够大，你又过量标记，加NaCl进去都不变色；又或者金子质量太差，或原料特殊，加进去NaCl所有条件都变色，甚至不加NaCl大部分条件都变色，这时你如果跟随NaCl的脚步，不一定带到哪条沟里去了，纠结于此往往不能发现背后真正的原因和解决方法。
对于部分IgG1型的抗体，NaCl滴定选择的条件会接近性能实验结果，但即使都是IgG1型抗体，标记、离心时的表现也会有很大差异，所以优化标记应以稳定高效的性能目标为指导，抛弃文献中的NaCl滴定法。
2）关于调节金子Ph：
常用的是碳酸钾梯度调节，Ph随着加入体积的增加而升高，这是一个相对连续的调节方法。有些公司使用缓冲液调节Ph，方法是加入相同体积、不同Ph的缓冲液，比如加入1/20的7.2的PB、8.0的BB、9.6的CB等等，这是一种跨步式的调节方式。两种方式调节均以加入量为参数，不必纠结具体的Ph数值，当选出最合适条件后，可以想办法检测一下这个点的Ph数值，在生产中作为一个质控点。
碳酸钾调节的优点是可以细化很多Ph梯度，从而利于追求性能，缺点是过于追求性能情况下，在临界状态附近放大标记，容易出现死金。
等比例放大，标记的整体Ph环境相同（1ml和几百ml，操作无错误，最终的胶体金Ph是一样的），那为什么小量标记没事，放大会死金呢，这是一个比较困惑的问题，可以从两方面理解（这只是我的推论，有助于理解现象）：
一是“狼多肉少”，胶体金是狼，蛋白是肉，少量标记时，假设在反应中心，1个金子标记上了蛋白，这时在反应区域外有9个等待标记的金子虎视眈眈，他抱着蛋白往外突围，走一步撞上1个金子，对方说“队长，别开枪，是我”，原来他走的同时，对方也标记上了蛋白，这时竞争比例变成了2:8，再走一步，比例变成了5:5，他最终突围出包围圈后，所有金子都标记好蛋白了，突围过程很从容，大家谁也不会抢谁的，相安无事。但是放大标记后，他突围了一层包围圈，遇到的是新的一批未标记的金子，再次勉强突围后，迎接他的又是新的一批没标记的金子，谁也别废话了，动手吧，最终抢来抢去，一个蛋白连上了多个金子就死金了。也就是放大标记中，整体Ph环境一致，蛋白的结合倾向是一致的，但是从反应中心扩散到整个区域的过程中，一个蛋白需要面对更多的金子的争抢，所以放大标记比小量标记容易死金。
另一个原因是局部ph降低，加入蛋白意味着引入了缓冲液（蛋白保存液），一般蛋白的保存液是PB，会拉低局部的Ph，放大标记，加入的蛋白保存液量明显增加，在这个局部反应区域内，蛋白是在低Ph环境下标记，更容易死金。
以上通用的解决办法就是要把标记Ph提高一些，在临界状态之后，性能满足要求的前提下，尽量往高提，能提高多少视蛋白结构和金子浓度而异。高倍金放大死金的风险远远高于常用的1/万金。
而缓冲液标记放大死金的风险相对较低，可能有两方面原因，一是本身缓冲对的缓冲能力大于单纯的碳酸钾，二是已经人为的加大了Ph的跨度（相当于碳酸钾梯度做大了，你选择的最优点已经是远离临界状态的安全点了）。
3）最适蛋白量：
过程类似，在最适Ph点上，把标记蛋白量做个梯度优化，梯度范围1ml金子加5-20ug蛋白。
优化标记量是因为免疫反应有比例性，夹心法一般标记量增加，一个金子上面标记上的蛋白就越多，与待测物反应越充分，整个复合物被T线捕获的机率也越高，灵敏度就越高，这个前提是上清游离原料去除干净，而这其实并不容易，所以标记浓度高了，游离抗体去除不干净引起的竞争效应会越明显，灵敏度反而降低，另外过饱和标记Fc相对隐蔽，对C线显色也有影响（参照下图，涛哥形象的画风）。
而竞争法相反，标记量越低，金子上的抗体越少，与阳性样本反应后，金子上留给T线的未反应抗体就越少，越利于消线，灵敏度越高。
优化蛋白标记量的主要筛选标准是产品性能，标记多少对金标物稳定的影响不是主要考虑项，所以更用不到NaCl滴定法。
4）封闭：
一般的文献都会说封闭是为了封闭金子表面的活跃位点，避免层析中出假阳，慢慢会发现除了这点，还有两个重要作用，一是稳定标记物，二是提供离心环境，这两个作用出镜率不及“封闭位点”，但是随着了解的更加深入，你会发现封闭表面的作用太肤浅了，“稳定标记物”和“提供离心环境”才是最重要的，解决死金的思路都在这里。
首推的封闭剂是BSA，质量很关键，涛哥有过长篇论述，不同厂家的BSA，在封闭时会有很大差异，所以，一开始选择一种好的BSA很重要（好在有人专门卖胶体金产品用的BSA，可以排除BSA厂家的因素，让你专注其他问题）。
如果操作过程中出现异常，观察每一步的实验现象会有助于发现和解决问题，与BSA相关的比如：
质量很好的BSA能够胜任绝大部分封闭工作，封闭离心复溶一切正常，而质量一般的BSA只能用于一部分标记单抗的封闭，如果标记特殊亚型单抗或者重组抗原，封闭没问题，但是离心会死金。
另外一些情况是，有些BSA溶解后是酸性的，用他封闭会导至标记蛋白带正电从而引起死金（可以尝试用Tris溶解BSA，整体呈碱性），有些BSA含杂质盐，用他封闭会破坏金标物的斥力从而引起死金。这两点基本上在封闭时就表现出异常了。
如果你常用的BSA没有换，标记的抗体也没有换，离心出现异常，多半是标记Ph和胶体金本身的质量问题。
在这里我想说一下我对BSA封闭机理的推论，我认为其主要作用力就是金硫键。BSA等电点4.7，我们标记时的Ph远大于其等电点，为什么一般情况下，我们标记抗体或抗原时，别说远远高于了，就是一般的高于等电点，标记后活性都大打折扣（标记效率极低），但是这个BSA封闭，无论什么Ph都能很好封闭胶体金裸露位点，而且还是人家抗体不愿意（难）结合的剩余位点，虽然BSA过量是一个因素，但是如果是很高的标记Ph，过量的蛋白进行标记也是浪费。不否认BSA浑身负电，仍有正电基团，但是Ph远远高于等电点，正电基团数量少得可怜，所以正负电荷引力难堪重任，甚至相互吸引接触都成问题。如果说主要靠疏水，在强大斥力存在时，疏水基团碰撞结合的几率也很低，那为什么其他蛋白远离等电点时，疏水结合很难起作用，但BSA却能很好结合？
所以最后只有一种可能，就是金硫键，BSA有581（也有说583）个氨基酸残基组成，分子量66.4KD，其中有35个半胱氨酸，组成了17个二硫键，在肽链的第34位还有一自由巯基。这个自由巯基很容易与胶体金形成共价结合，而且共价结合力远远强于静电和疏水，同时他不受Ph条件的影响，并且共价键具有饱和性，所以一个BSA只能通过一个自由巯基结合一个胶体金，不会引起金子的聚集，但是一个胶体金可以结合多个BSA，所以封闭后的金标物带有更多负电荷，能够更稳定、更分散。
实验现象表明BSA的加入，会让某些轻微变紫色的金子回复成红色，这是本已聚集的胶体金颗粒重新分散的表现，这说明BSA在封闭时有很强的负电斥力，并且很高效的结合到了胶体金上，与上面的推论相吻合。
所以我认为，金硫键是BSA封闭胶体金时的主要作用力。关于BSA的封闭机理，每个人会有各自的看法，至少目前没有统一的定论，这只是我根据几种作用力的原理及实验现象得出的推论，大家看看就行，反正不知道原理，直接用也不会有问题。
另外一个常用的封闭剂是酪蛋白，比BSA保护作用更强，甚至标记时已经死了的金都能安全离心，这是一件好事，也是一件头疼的事，可以慢慢体会。但是刚接触一个项目的时候，不建议用酪蛋白封闭，如果对反应体系不了解，酪蛋白封闭容易筛选出有缺陷的原料，从而引发一系列意想不到的问题。常见的降低灵敏度、产品特异性缺陷，罕见的金子释放异常等。
未完待续……
第二话——标记（下）
5）离心纯化：
目的有几方面：去除游离蛋白；置换储存液；浓缩。高速离心，本身是一个加速破坏的过程，所以离心需要平衡两点，“上清干净”和“无不溶颗粒”，这两个矛盾的问题在小量离心时不明显，但是大量离心就讲究了，以下引自涛哥答疑录：
“关于金标记物的离心方法，五花八门，各种各样的都有，比如：有人先低速离心，去掉大颗粒沉淀，再高速离心，去掉上清；有人直接一步离心，去掉上清；有人梯度分步离心，离心三次；有人梯度分步离心，离心两次。具体需要采用哪种离心方法，跟金的质量、 标记物质、体积、颗粒大小都有关系。梯度分步离心，转速是逐步升高的，举个例子：比如一步离心某个金标记物，需要10000rpm 离心2小时才能离心彻底，梯度分步离心可以这么做，6000rpm 离心半小时，分离上清和沉淀，8000rpm 离心半小时，分离上清和沉淀，12000rpm 离心，直至上清清澈，去掉上清，将三次沉淀混合复溶。这么做是为了避免最先离心下来的金标记物，被长时间高速挤压而聚集。”
6）复溶：
很多新人一上来喜欢要配方（这情有可原，因为新手对体系没有概念，不知道各种物质的作用，很难下手），而很多老司机讨厌直接要配方（这也没错，因为做的项目多了，多少都会有针对性的调整，一张配方吃天下是很难的，拿到原料都会先摸一下脾气，再针对性调整，所以从心里抵触那种重配方轻实践的思想）。
我们悬浮金子，首先要保持金标物液态稳定，然后是干燥过程中稳定，然后是干燥后稳定并且充分释放，我在这里从理论上介绍一个基础配方，再简单介绍几个常见的使用物质的添加思路：
我们先看一个基础配方：0.01MTris-HCl Ph8.5+1%BSA+10%蔗糖。
首先是缓冲液：金标物标记的是蛋白，蛋白需要保存在缓冲体系中，所以我们需要一种缓冲基质，而标记中我们讲了Ph对蛋白电荷的影响，虽然已经标记并且封闭了，但是低Ph使蛋白带更多正电荷，仍然会导至金标物交联死金，所以我们需要较高的Ph，这是我们不用7.2的PB的原因；太高的Ph又会使蛋白与金的电荷斥力增大，有脱落的风险，所以Ph又不能太高，最终Ph8.5的Tris缓冲液脱颖而出，大部分单抗的等电点在8.2，8.5这个Ph可以保证标记抗体带少量负电荷维持标记物整体稳定，对于等电点不确定的重组抗原，Tris这个缓冲基质也完全胜任。离子本身对金标物有破坏作用，所以我们用很低的摩尔浓度，更不会主动添加NaCl（需要的话，一般是加在样品垫或者样品缓冲液中）。
然后是BSA： BSA有几个作用，一是高浓度杂蛋白的存在，有利于保护标记蛋白；二是用高浓度BSA封闭金垫，金垫上如果有易吸附蛋白的位点，就让他吸附BSA，从而使金标物能够顺利释放出去；三是流动封闭NC膜，NC膜通过电荷和疏水两种作用，极易吸附金标物，产生层析不干净、T线反白等异常问题，而BSA在层析过程中，一边流动一边对NC膜进行封闭（所谓的流动封闭），可以明显改善这种异常现象；四是BSA可以对蛋白之间的非特异反应起到一定的封闭作用。
最后是糖：糖作为一种干燥保护剂，阻止蛋白在干燥过程中变性（两种假说，代替水化膜保护氢键和结合水，形成玻璃态保持蛋白三维构象），他可以提供一个相对亲水的环境，避免金标物通过疏水作用与金垫牢固结合。所以稳定性（长期或加速）出现金子不释放的情况，多半是没有加糖，金子上蛋白与金垫发生了牢固吸附导至的。另外金子吸潮后也会出现释放困难的问题，而糖加多了对湿度更敏感，所以一般加10-20%。
这是一个基础配方，组成的思路就是这样，基本上可以通用了。我们搞配方，不是打网游，基础不等于白字装备，而动辄7、8个、十几个成分的配方也等于牛逼的橙色史诗装备，他一般都是特事特行，根据需要调出来的，是一个无奈的产物，正常的配方就应该宜简不宜繁，越简单适用性越广，越容易控制，出问题也越容易分析。
下面简单介绍一下其他添加其他物质，比如：
表面活性剂（吐温）：促进释放的作用，但是物理吸附中疏水作用占很大比例，在液相中如果表活浓度过高，金标蛋白有脱落风险。另外，有吐温的存在，干燥后吸潮的风险大大增加，对环境湿度的要求更高。所以还是尽量少加，而且含表活的金标物尽量不要液态长时间存放。
高分子聚合物（PVP、PEG）：本身对释放有一定的促进作用，而且可以促进反应，但是引起非特异性反应的风险也较高。另外加在金垫中，在干燥过程中会迫使金标蛋白相互聚合，从而形成大的颗粒，正面作用是提高了灵敏度，负面作用是容易出假阳，而且在某些时候引起颗粒过大，在NC膜底部会出现不能顺利层析的颗粒物。
酪蛋白：在某些情况下，有促进金子释放的作用，一般用不到。另外对蛋白间的非特异反应有很强的封闭作用，但是其本身对正常的免疫反应的封闭作用也很强，所以视情况而加。
海藻糖：对蛋白的保护作用强于蔗糖，成本相对较高，如果金子稳定性有问题，尤其是加速稳定性出问题，可以再加点海藻糖。
7）金垫：
材质常用的有几种，包括玻纤、聚酯和无纺布。没有谁好谁不好的说法，主要选择依据是均一性，其他的根据自身需要来选择，比如厚度、承载量、释放速度（一般聚酯的释放速度快于玻纤）等。不同材质、型号的金垫，有些可能需要前处理，如果能够正常铺金、正常释放，一般直接用也没啥大问题。
4.质量检验：
检验成功标记的方法只有组装成品，进行性能测试这一种方法。
除了死金等异常外，常见的失效模式有两种，一是没有标记上（废话），二是标记后没有活性或者活性不达标，这两点通过性能检测一步到位。
通常文献中介绍的分光光度计扫描法，会有最大吸收峰右移的现象，这只能说明标记上了东西（粒径增大），但是即使没标记上目标原料，BSA的封闭也会稍微增大粒径的，况且成功标记上原料，性能不达标也是白瞎，所以这个不能用作金标物的质量检验。
但是分光光度法扫描也不是没有用处，可以用作控制复溶比例（金标物浓度）的一个指标。而且引申一下，最大吸收峰右移现象，可以帮助我们分析标记物没活性的原因（对比正常的标记结果，看右移现象及程度，可以知道这个失效是没标记上，还是标记了但没活性。这一点是我的猜测，没实际用过，因为物理吸附很少出现这种情况，而共价标记中buffer选择不合适，标记不上的现象会很常见，测粒径变化可以帮助我们分析标记结果）。
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