hESCs的分离及建系

实验概要

hESCs的分离及建系

主要试剂

hESCs培养液、DPBS、0.25%Trypsin、1 mg/mL胶原酶Ⅳ、丝裂霉素C、0.1%明胶、囊胚培养液G2、胚胎冻存液、细胞基础培养液

主要设备

35 mm培养皿、4孔培养板、滤器、注射器针头；2 mL、5 mL、10 mL、15 mL、25 mL、50 mL离心管、计数器、巴斯德管、倒置显微镜、生物安全柜、体视镜

实验材料

人5-7 天的植入前胚胎【胚胎干细胞的建系通常是使用做试管婴儿之后剩余的胚胎，解冻之前要征求捐赠者的同意或之前签订相关知情同意书等协议】

实验步骤

（1）胚胎复苏和培养
①装有胚胎的冻存管从液氮取出之后在室温中静置30 s，然后转入30℃的水浴锅中30～40 s。
②将胚胎在0.5、0.2和0.1 M蔗糖的冻存液中孵育10 min。
③之后在室温和37℃的冻存缓冲液中分别孵育10 min。
④在囊胚培养液G2中进行培养。
！注意：复苏冻存的胚胎是一个繁琐的过程，只有严格按照上述步骤才可能获得较高质量的胚胎。
（2）饲养层细胞的复苏
饲养层细胞的制备见本章第二节丝裂霉素C制备饲养层，饲养层细胞的复苏见第二章细胞复苏的常规方法，在胚胎接种前1~2天复苏细胞，细胞密度约为7x10⁴~2×10⁵/cm²。
！注意：建系过程中饲养层的密度和质量非常重要，建议用CF-1品系的饲养层。饲养层是培养胚胎干细胞的关键之一，品系和密度同时影响胚胎干细胞的质量，建系的饲养层细胞的密度约为7×10⁴/cm²。
（3）内细胞团的分离与接种
①在35 mm培养皿内用hESCs培养和建系液做几个20～30μL的液滴。
②用口控吸管将囊胚移入上述液滴中。
③用两个28 G的注射器针头调整胚胎的位置，使胚胎内细胞团处于焦面并在0点钟位置，然后用玻璃针【镊子夹住1.0×0.8 mm规格的玻璃管在酒精灯上烘烤灭菌；用左手持镊夹住玻璃管左端，右手拿住右端，用酒精灯外焰烘烤左端，待玻璃管融化时，左右手分别向外快速成120°角抻拉，断开后，右手端持取的玻璃管就可用于克隆挑取相关实验。】将透明带划开。
！注意：玻璃针在hESCs建系和传代过程中会频繁使用，根据不同的用途，可以随时调整玻璃针的大小，韧度和形状。
④调整胚胎的位置，一个针头进行固定，一个针头沿着内细胞团的平行界面将胚胎切为两部分，吸出含有内细胞团的部分，放入盛有hESCs培养液的铺有饲养层的培养板中。
！注意：建系时一般用24孔培养板，形成Outgrowth后挑克隆，一个克隆接种到一个24孔培养板的孔，随着传代克隆逐渐增多，所用培养板逐渐调整到12孔培养板，6孔培养板，hESCs的稳定传代一般用6孔培养板。
⑤4～6天后可以发现有相应的克隆状细胞团，这时可以用玻璃针【镊子夹住1.0×0.8mm规格的玻璃管在酒精灯上烘烤灭菌；用左手持镊夹住玻璃管左端，右手拿住右端，用酒精灯外焰烘烤左端，待玻璃管融化时，左右手分别向外快速成120°角抻拉，断开后，右手端持取的玻璃管就可用于克隆挑取相关实验。】挑取较致密的克隆。
⑥前10代一般都需用机械法传代【用玻璃针将培养5-7天的hESCs克隆切成很多小的克隆，然后吸出，放入新鲜的培养液中。】，用玻璃针挑出较致密的克隆。
！注意：机械切割不宜操作时间过长，防止hESCs培养液的渗透压发生变化进而影响到胚胎质量。
每个胚胎用单独的针头，防止交叉污染。
胚胎切割动作要快，防止粘针。
可以调整胚胎以确定内细胞团的位置。
内细胞团种入三天内勿动培养皿，这样更利于细胞贴壁。