类器官(Organoids)是将具有干性潜能的细胞在体外进行3D培养，形成多种特异性细胞类型集合的微器官团，能够体外再现真实器官的三维构造及生理功能。然而体外培养的类器官往往缺乏有效的血管，随着类器官体积的增加，缺氧及代谢废物累积导致细胞凋亡，最终致使组织坏死，因此目前培养的类器官无论是形态大小还是生理功能都无法做到完全模拟真实的组织器官，这也是类器官培养技术发展的重大瓶颈之一。类器官的血管化研究一直是类器官研究领域的热点与难点。本文中，我们整理了近年来科学家们在类器官血管化研究领域的进展，分享给大家。
01 脑类器官血管化研究
有研究表明中枢神经系统在发育过程中不会产生血管祖细胞[1]，血管祖细胞的缺乏则阻碍了类器官的血管化进程。为了培养血管化的脑类器官，2018年Pham
MT等[2]将同一患者来源的人诱导多能干细胞(iPSCs)衍生的血管内皮细胞(ECs)与脑类器官共培养，移植入免疫缺陷的小鼠脑内。移植当天免疫荧光检测结果显示CD31阳性细胞围绕在类器官周围，移植后随着脑类器官在体内的进一步发育成熟，切片染色结果显示新形成的人毛细血管强有力的向脑类器官干细胞核心区渗透，核心区外围则显示出典型的连续性内生化血管网络结构。未血管化的脑类器官在移植后则无法存活，然而该研究尚未涉及移植物类器官血管与宿主血管之间的相互作用。
脑类器官染色图，白色箭头为新生血管[2] hCD31为血管细胞标志物；STEM121为人脑干细胞标志物；DAPI为细胞核染料。
2018年Mansour AA等[3]在体外将人胚胎干细胞(hESC)诱导分化为小型脑类器官后，直接移植入免疫缺陷小鼠软脑膜血管上。移植的类器官继续进行神经分化和成熟并与小鼠脑组织进行了很好的整合，双光子扫描成像结果显示小鼠血管侵入移植物并生长延伸，血管内血流活跃，移植物类器官功能性血管网络发展良好。
小鼠脑内脑类器官血流图[3]
人类ETS变体2(ETV2)转录因子与人血管内皮细胞的形成高度相关。2019年Cakir
B等[4]设计了一种表达人类ETV2转录因子的hESCs细胞，诱导该细胞分化成为带血管蒂的人皮层脑类器官(vhCOs)。体外培养的vhCOs体积、神经细胞存活率均显著大于对照组。在vhCOs中部分特殊的内皮细胞还形成了神经周血管丛，并与脑内的神经血管紧密相连，十分类似于血脑屏障结构。将该vhCOs移植入免疫缺陷的小鼠腿内，FITC灌注结果显示ETV2诱导的内皮细胞支持功能性的血管系统形成。
2020年Shi
Y等[5]则是将hESCs或iPSCs与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养，定向诱导其分化为血管化的脑类器官。免疫荧光染色结果表明，HUVECs在脑类器官中相互连接，并形成具有通透能力的复杂血管系统，该血管系统可以在脑类器官中可稳定存在200天以上。研究者将血管化脑类器官植入免疫缺陷小鼠脑内S1皮质空洞中，免疫荧光检测结果显示在脑类器官移植物中HUVECs
与宿主小鼠血管内皮细胞发生了整合，并在脑类器官中形成了有血液流动的功能性血管网络系统，支持其成熟存活。
02 肝类器官血管化研究
2011年Baptista PM等[6]使用灌注洗涤剂去除肝脏组织的细胞成分，同时保留了完整的的血管网络。将hUVECs和人胎肝细胞(hFLCs)接种到脱细胞支架中，利用肝脏内部血管网络包括大血管及微血管网络结构，实现肝脏组织的血管化培养。
肝脏脱细胞后血管脉络图[6]
2013年Takebe
T等[7]将iPSC诱导形成的肝内胚层细胞与HUVECs和人骨髓来源的间充质干细胞(hBMSCs)共培养，待其形成具有三维球状组织的肝芽(iPSC-LBs)，移植入免疫缺陷的小鼠中。移植48小时内免疫荧光检测结果显示移植的iPSC-LBs血管与宿主血管相互连接形成复杂的血管网络，实时成像结果确认了宿主血液灌注到新形成的人体功能性血管网络中。
03小肠类器官血管化研究
Holloway
EM等曾在小肠类器官的形成早期，检测到大量的内源性血管内皮细胞，然而随着培养时间的推移，血管内皮细胞(ECs)逐渐发生凋亡。2020年，他们在常规肠类器官培养方法的基础上，在培养体系中加入EGF,
VEGF,
BFGF和BMP-4等细胞因子，诱导内源性ECs共分化，从而形成血管化的小肠类器官(vHIOs)[8]。体外培养数周后，免疫荧光法检测结果显示vHIOs间质内存在大量CD31/CD144双阳ECs细胞，证实了内源性ECs的富集，ECs在培养体系中可长期存活2个月。
hPSC来源的小肠类器官(vHIO)及对照组染色图[8] ECAD为蛋白染色；CD144为EC细胞标志物。
04肾脏类器官血管化研究
2019年Low
JH等[9]通过动态调节WNT信号通路，控制近端肾小球和远端肾小管的比例，调节近端足细胞释放血管内皮生长因子A(VEGFA)的水平，进而诱导血管化的肾脏类器官分化形成。免疫荧光检测结果明确了肾脏发育的起始阶段存在内源性血管内皮祖细胞，血管内皮祖细胞的发育依赖于足细胞分泌的VEGFA，并且VEGFA的分泌量决定了血管网络的丰度。血管化的肾脏类器官移植入宿主小鼠后，继续发育成肾小球毛细血管簇，右旋糖酐灌注实验结果显示与野生型小鼠肾脏类似，移植的肾脏类器官具有初步的过滤和重吸收功能。
第24天，肾类器官免疫荧光染色图[9] CD34为ECs表面标志物; CD31为ECs表面标志物; NPHS为肾足突细胞标志物; DAPI为细胞核染料。
目前仅有少数种类的类器官血管化培养成功，该研究仍任重而道远。诱导类器官血管形成的决定性因素尚不清楚。不同种类类器官血管化培养的条件也不尽相同。虽然血管化研究道阻且艰，但随着研究者的不断探索，或许在不久的将来，科学家们可以成功在体外构建具有血管可供移植的类器官，以造福人类。在科研的道路上迎难而上，终会破茧成蝶！
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参考文献
1. Bautch VL, et al. (2009) Neurovascular development: the beginning of a beautiful friendship. Cell Adh Migr. 3:199–204.
2. Pham MT, et al. (2018) Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport . 29(7):588-593.
3. Mansour AA, et al.(2018) An in vivo model of functional and
vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol . 36(5):432-441.
4. Cakir B, et al. (2019) Engineering of human brain organoids with a
functional vascular-like system. Nat Methods. 16(11):1169-1175
5. Shi Y, et al. (2020) Vascularized human cortical organoids
(vOrganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol.
18(5):e3000705.
6. Baptista PM, et al. (2011) The use of whole organ
decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.
Hepatology, ,53(2): 604-617
7. Takebe T, et al. (2013) Vascularized and Functional Human Liver
From an iPSC-derived Organ Bud Transplant. Nature. 499(7459):481-4.
8. Holloway EM, et al. (2020) Differentiation of human intestinal
organoids with endogenous 1 vascular endothelial cells. BioRxiv
angiogenesis in tissue-engineered intestine. Biomaterials. 29(19): 2884- 2890
9. Low JH, et al. (2019) Generation of human-PSC derived kidney
organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular
network . Cell Stem Cell. 25(3):373-387.e9.
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