电转化连接物及构建抗体文库

实验概要

本实验通过电转化连接物，构建了抗体文库。

主要试剂

1. SOC培养基(将20g细菌培养用胰蛋白胨、5g酵母提取物及0.5g NaCl溶于950ml水中。加入10m1 250mmol/L KCl，5mol/L NaOH调整pH至7.0并加入去离子水至IL。高压灭菌。手感变凉后，再加入5ml 2mol/L MgCl₂和20ml lmol/L葡萄糖)

2. 100mm和150mm含100ug/m1氨苄青霉素和2%葡萄糖的TYE平板(TYE/amp/glu)(将16g细菌培养用胰蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl和15g细菌培养用琼脂加入到去离子水中并调整体积至1L。高压灭菌。当溶液手感变凉时，加入氨苄青霉素和葡萄糖并倒板)

3. 含100ug/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的2×TY培养基(2×TY/amp/glu)

4. 50%甘油

主要设备

1. 37℃孵育箱(NewBrunswick)

2. 电转化仪及0.2cm间距小杯(GenePulser^TM Biorad)

3. 16℃水浴仪器

实验材料

电感受态大肠杆菌TG1

实验步骤

1．将电转化仪设置为200D(电阻)、25rtF(电容)和2.5kV。

2．在冰上复溶电感受态细菌或使用新鲜制备的电感受态细胞。将电转化杯、杯固定夹、细胞和DNA均放于冰上。

3．将80ng已纯化且无盐的DNA与50g1细菌混合。冰上孵育混合物1分钟。

4．将混合物转移至0.2cm间距的电转化杯中，小心操作切勿在电极间留气泡。轻拍小杯，使所有液体均沉淀于瓶底。迅速转移以使小杯处于低温状态。

5．将透明杯放入电转化仪内，确保小杯侧面干燥(以免电弧)。启动脉冲，立即加入1.0ml SOC培养基并混合。时间恒定值应在4.5～5.5毫秒范围之间。如果时间恒定值小于4.3秒，则重复DNA沉淀。

6．在每次电转化后的细菌中加入lmlSOC培养基，以250r/min振荡培养，37℃1小时。

7．合并所有电转化培养液，系列稀释后在100mm TYE/amp/glu平板上铺板确定文库容量。

8．以200g、4℃10分钟离心剩余的细菌培养液。将每4次电转化的沉淀重悬于500u1的体积。以每份125ul等量体积分别铺于150mmTYE/amp/glu平板上或将500ul铺于含TYE/amp/glu的Nunclon quare ishes500cm²。将这些平板在30℃下培养过夜。

9．加入10m1含15%甘油(0.2gm滤膜过滤除菌)的TYE/amp/glu培养基；刮取平板上的细菌。在-70℃下储存抗体文库。