实验概要

虽然体细胞克隆技术已经在不同物种的基因重编程基础研究中广泛应用，但是近十年来利用该技术成功制备胚胎的效率特别低。特别是在小鼠上，可克隆的小鼠系主要限于仔一代，如B6D2F1。最近，我们将TSA引进克隆技术中，使B6D2F1 小鼠卵丘细胞为供体细胞的核移植胚胎成功制备率提高了2-5倍。为了进一步验证TSA克隆技术的有效性，我们设计试验：利用TSA处理制备远交系ICR成鼠。

实验步骤

1. 供体细胞与受体卵母细胞的收集

常规超排雌鼠(eCG 5IU，48h后hCG 5IU)获得卵丘卵母细胞。注射hCG后，13-15h从小鼠输卵管中冲出卵丘卵母细胞，放在0.1%透明质酸酶的Hepes-CZB中37℃ 10min。取ICR雄鼠尾尖，将尾部皮肤取下剪碎，放在35mm培养皿中加5ml 10%胎牛血清的DMEM培养液。10-14d，待细胞长满培养皿时，将细胞传代。

2. TSA处理核移植后的胚胎并制备克隆后代

利用成鼠卵丘细胞或尾尖细胞作为核供体。利用Piezo装置，以ICR小鼠的卵丘细胞或尾尖细胞作为供体细胞，以B6D2F1小鼠卵母细胞作为受体细胞，制备核移植胚胎。所述利用TSA处理重构胚。用10mM SrCl₂、5µg/ml CB、5或50 nM TSA的无Ca² CZB培养重构胚6h，后用含上述同样浓度TSA的KSOM培养液培养4h。然后用不含TSA的KSOM培养液培养到2-细胞阶段，最后移入ICR假孕母鼠体内。所有代孕母鼠在见栓后19.5d 安乐死，所有克隆幼鼠用ICR母鼠代哺乳。