酵母功能互补实验

实验概要

本实验将在构建了大蒜重金属抗性基因表达载体并转入大肠杆菌DH5α的基础上，选择鉴定准确的质粒转化酵母细胞，对转化子进行了PCR鉴定和RT-PCR分析，及重金属抗性实验。

主要试剂

YPD培养基，醋酸锂，PEG(50%)，乙醇，少量酵母菌总RNA快速抽提试剂盒

主要设备

摇床，离心机，水浴锅，PCR仪，电泳装置

实验材料

重组大肠杆菌DH5α(含大蒜重金属抗性基因的克隆)

实验步骤

1 酵母转化

   1) 接种5 ml液体YPD，30℃下振荡培养过夜；

   2) 计数过夜培养物细胞密度。以最终5X10⁶/ml的细胞密度接种100 ml YPD培养基；

   3) 置30℃，200 rpm/min振荡培养至2 X 10⁷/ml，通常需要3-5小时；

   4) 用50 ml无菌离心管以3000 X g离心5 min，收获细胞；

   5) 弃培养液，悬浮细胞于25 ml无菌水中，同上离心；

   6) 弃水，把细胞悬浮在1 ml的100 mmol/L的醋酸锂中，转悬浮物到一个无菌1.5 ml的离心管中；

   7) 离心5 sec沉淀细胞，吸出醋酸锂；

   8) 悬浮细胞至终体积500 ul体积，其中大约含有400 ul的100 mmol/L醋酸锂；

   9) 将1 ml单链单体DNA样品煮沸5分钟，快速在冰水中冷却；

   10) 振荡细胞悬浮液，取50ul样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，除去醋酸锂；

   11) 按照下列成份配置“转化混合液”：

        240 ul     PEG(50%)

        36 ul      1.0 mol/L醋酸锂

          25 ul      单链载体DNA (2.0 mg/ml)

          50 ul      水和质粒(0.1-10 ug)

   12) 剧烈振荡每个反应管至细胞完全混匀，通常要1 min；

   13) 30℃保温30 min；

   14) 42℃热激20- 25 min；

   15) 6000-8000 rpm/min离心15秒，除去转化混合液；

   16) 吸0.2-1.0 ml无菌水加到每个反应管中，轻轻悬浮沉淀；

   17) 用等份的200 ul转化混合液涂选择平板。

2. 转化子的筛选

转化的酵母菌株涂到缺Leu的SD培养基上，30℃培养72小时。挑取阳性克隆。对阳性克隆进行菌落PCR鉴定。

3. 酵母转化子的RT-PCR分析

根据少量酵母菌总RNA快速抽提试剂盒的说明书进行：

   1) 将酵母菌(≤5 X 10⁷)移入离心管中，离心10 sec，去上清。

   2) 加入500 ul DY液，彻底振荡悬浮；

   3) 加200 ul Lyticase混匀，30℃温育15-30 min，500 X g离心5 min，弃上清；

   4) 加500 ul TCL液，立即盖盖，高速振荡5 min，12000 X g离心3 min，保存上清；

   5) 加入上清的1/2体积的75%的乙醇，彻底混匀，移入吸附柱，离心30 sec弃滤液；

   6) 加500 ul RP液，离心30 sec，弃滤液；

   7) 加500 ul W3液，静置1 min，离心15 sec，弃滤液；

   8) 离心1 min；

   9) 加50 ul H₂O，静置1 min；

   10) 离心1 min。

4. 重金属抗性实验

   1) 挑取转化的酵母单菌落于30℃培养酵母24-48 hr；

   2) 调节酵母的浓度至OD值1.0，然后分别稀释10倍、100倍、1000倍后，各取2ul于含有不同浓度重金属离子的SD培养基(Leu)上。重金属浓度分别为：

       Na₃AsO₄：0，100 umol/L，300 umol/L和500 umol/L，1000 umol/L

       CdCl₂：0，50 umol/L和100 umol/L}，30℃培养72 hr ；

   3) 观察结果。