4.软琼脂克隆分离法
本法仅适用于悬浮培养的类淋巴细胞或恶性程度高的贴壁细胞，而正常贴壁细胞在软琼脂中不能形成克隆。
（1）将对数生长期的细胞制成单个细胞悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成单个细胞)作活细胞计数。调整细胞浓度至1×106细胞/L，然后根据实验要求再作梯倍稀释。通常以1~5×104个细胞/L为佳。
（2）制备底层琼脂 取5%琼脂置沸水中，使琼脂完全溶化，取出一份5%琼脂，移入小烧杯中，待冷至50℃，迅速加入9份预温37℃的新鲜培养液（即成为0.5%琼脂），混匀后立即注入24孔培养板中，每孔含0.5% 琼脂0.8mL，置室温使琼脂凝固备用（此层也可以省略）。
（3）制备上层琼脂 取37℃保温的、不同浓度的细胞悬液9.4mL，移入小烧杯中，加入50℃ 5% 琼脂0.6mL迅速混匀，即配成0.3%琼脂培养基，立即浇入铺有底层琼脂的24孔培养板中，每孔0.8ml，置室温使琼脂凝固。
（4）于37℃ 5% CO2下培养1~2周或更长，若需培养更长时间可补加0.8mL/孔含琼脂的培养液，待有明显集落形成为止。
（5）集落（克隆）计数：在倒置显微镜下观察并计数直径大于75μm或含有50个细胞以上的克隆。
5．单细胞显微操作法
借助显微操纵器，在显微镜监控下将单个细胞逐个吸出，移入含有饲养层细胞的培养板中进行培养。本法准确性好，如无显微操纵器可自制毛细吸管替代。
方法如下：
（1）饲养层细胞的制备 单个细胞在极低密度下生长非常缓慢，甚至难以分裂，为了促进克隆细胞的生长繁殖，常采用饲养层细胞，饲养细胞种类和制备方法依实验要求而定，现以3T3小鼠纤维细胞为例：
①用0.25%胰蛋白酶消化单层贴壁生长的3T3细胞，调整细胞浓度为108细胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL细胞悬液于37℃ 5% CO2中培养至单层。
②将已形成单层的3T3细胞板，用60Co γ线以4000～6000拉得辐射或在培养液中加入丝裂霉素（终浓度为10-6mol/L）作用16h。其目的是使细胞有丝分裂能力丧失，但仍可短期存活，有代谢功能，不仅可维持pH而且还可为克隆细胞提供必要的养分及刺激生长的因子。饲养细胞处理后需更换新鲜培养液。
(2)制备单个细胞悬液 方法同上。
(3)分离单个细胞 其方法多样，可根据实验条件决定：
①毛细管吸入法 同上述毛细管法，在显微镜下将只有一个细胞的毛细管取出。
②微滴法 将经稀释至103个细胞/L的单个细胞悬液，用无菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在显微镜下挑选出单个细胞的液滴，再用毛细管取出单个细胞悬滴。
③液体石蜡法 将经稀释至103个细胞/L的单个细胞悬液，用无菌的1mL注射器逐滴加入充满无菌液体石蜡的平皿底部，在倒置显微镜下挑选只有一个细胞液滴，仔细用毛细吸管取出有一个细胞的液滴。
④玻璃小球附着法 将稀释至103个细胞/L的细胞悬液加入表面涂有无菌凡士林石蜡的小玻璃珠的平皿中，混匀后，在倒置显微镜下挑选玻璃珠表面只粘附一个细胞的玻珠，仔细用镊子取出。
(4)将采用上述方法分离出的单个细胞，放入预先制备饲养层细胞的96孔培养板中，于37℃ 5% CO2下培养1~2周或更长。
(5)待细胞克隆明显，并使孔底覆盖1/3～1/2时，即可将细胞转种于24孔板进行扩大培养（贴壁细胞仍需用0.25%胰酶消化法取出转种）。
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