（2） 胶原酶（Collagenase）消化法
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。
经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。
鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性（见表4-1）和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间（小时）有差异（见表4-2），以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶（对细胞表面糖基有作用），采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。
表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别
| 项 目 | 胰蛋白酶 | 胶原酶 |
| 消化特性 | 适用于消化软组织 | 适用于消化纤维多的组织 |
| 用 量 | 0.01%~0.5% | 0.1~0.3mg/mL（200u/mL） |
| 消化时间 | 0.5~2小时（小块） | 1~12小时 |
| pH | 8~9 | 6.5~7.0 |
| 作用强度 | 强烈 | 缓和 |
| 细胞影响 | 时间过长有影响 | 无大影响 |
| 血清、钙、镁离子 | 有影响 | 无影响 |
表4-2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间（小时）（0.5~1cm3）
| 酶 种 类 | 较 硬 组 织 | 软 组 织 | ||||
| 4℃ 室 温 37℃ | 4℃ 室 温 37℃ | |||||
| 胰蛋白酶（0.25%） | 24~48 | 1~6 | 1~2 | 12~24 | 1~2 | 0.5~1 |
| 胶原酶（200u/mL） | 24 | 6 | 6.5 | 12 | 3 | 0.25 |
| 两者联合（对冲） | 12~46 | 12~24 | 4~12 | 12~24 | 6~12 | 1~2 |
除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene,全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。
消化分离法的操作步骤：
（1）剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。
（2） 加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。
（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。
（4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。
（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。
（6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
注意事项如下：
（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
（2）胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。
（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。
首页
