酵母遗传学方法5：酵母β－半乳糖苷酶的测定

酵母β－半乳糖苷酶的测定

1）  粗提取物测定

1．在适当温度下（通常30℃），用适当培养液将5ml细胞培养物培养到浓度为1×10⁷～2×10⁷细胞/ml。如果自主复制质粒的杂合基因表达，可使用一种适当培养基对存在质粒的菌株进行筛选。

2．在冰上冷却细胞，离心收集。注意：以下步骤保持细胞在冰上。

3．弃上清液，将细胞悬浮于250μl裂解缓冲液中，然后置－20℃冻结，以备的第二天测定。以下步骤均在1.5ml离心管中进行。

裂解缓冲液：

100 mmol/L Tris-HCl (pH8)

1 mmol/L 二硫苏糖醇

20％ 甘油

4．若细胞冻结，可在冰上将其冻结。加玻珠恰好到液面下，再加12.5μl PMSF母液。

5．以高速振荡混合6次，每次15秒，间歇时放在冰上。

6．加入250μl的裂解缓冲液，用1000μl移液器插到离心管底部抽打使其充分混匀。

7．离心15分钟澄清提取物。如果活性成分存在于颗粒状碎片中，则可用未澄清的上清液，而测定的混合物将在步骤8澄清。

8．测定：

a.       加10～100μl抽提物到0.9ml的Z缓冲液中，用裂解缓冲液定容至1ml。

Z缓冲液：

16.1 g   Na₂HPO4•7H₂O

5.5 g    NaH₂PO4•H₂O

0.75 g   KCl

0.246 g  MgSO₄•7H₂O

2.7 ml   β-巯基乙醇

用蒸馏水定容至1升

调pH至7.0，保存于4℃

b.      在28℃水浴中将混合物保温5分钟。

c.       加入0.2ml临硝基苯-β-D半乳吡喃糖苷（ONPG）母液，开始反应，注意准确时间，在28℃下保温至混合物产生淡黄色。

d.      加入0.5ml碳酸钠母液终止反应，注意准确记录反应终止的时间，在420nm波长下测定光密度。

9．采用Bradford（1976）染料结合测定法测定抽提物中的蛋白质浓度。

a.       用蒸馏水将Bradford试剂稀释5倍。用Whatman540号滤纸过滤稀释试剂。

b.      加10～20μl抽提物到1ml稀释试剂中，并混合。在595nm波长下测定形成的蓝色溶液。用一次性塑料比色杯以防止形成蓝膜影响测定结果。

c.       将BSA溶解于裂解缓冲液中，选用几个不同稀释度（0.1～1mg/ml）制成标准曲线。

10．  根据下面公式计算抽提物的特异活性：

                          OD₄₂₀×1.7            

0.0045×蛋白质×抽提物体积×时间

2）  通透细胞测定法

1．按上述方法培养细胞，测定培养物的OD₆₀₀，当培养物细胞密度达1×10⁶～1×10⁷细胞/ml，同方法1离心收集细胞。

2．弃上清液，将细胞悬浮于1ml Z缓冲液中。

3．加入3滴氯仿和2滴0.1％ SDS，高速振荡10秒钟。

4．28℃下预保温样品5分钟，同方法1加入0.2ml ONPG开始反应。

5．当试管中的样品变为淡黄色时，加入0.5ml碳酸钠母液终止反应。注意在测定时所花时间，离心10分钟，弃细胞碎片和沉淀物。

6．测定反应物OD₄₂₀的光密度。

7．β-半乳糖苷酶的活性单位为：

                             OD₄₂₀                   

培养物OD₆₀₀的光密度×测定体积×时间