原位合成的基因芯片制备技术

生物芯片制备中材料的固定方式主要包括原位合成法和点样法两种，点样法又分为接触式点样法和非接触式点样法。原位合成法主要用于基因芯片的制备，点样法可用于基因芯片和蛋白质芯片的制备。细胞芯片主要是通过细胞本身的贴壁生长来完成固定。组织芯片通过一些黏性溶剂(如石蜡)使组织切片固定在载体上。某些微流体芯片不需要材料的固定，只是通过硅材料上大量的微通道来完成检测，另外一些微流体芯片通过特殊的作用(如蛋白质的特异性结合、序列互补DNA片断等)把材料固定在微粒上来完成检测。在此我们主要介绍原位合成技术和直接点样技术。

    原位合成是直接在固体基质上用4种单核苷酸合成所需的DNA片段。Affymetrix公司的GeneChipTM是高密度寡核苷酸微阵列原位合成的代表，制造工艺采用原位光刻合成。其他原位合成制造工艺还有光敏抗蚀层并行合成法、微流体通道在片合成法、喷印合成法及分子印章在片合成法。

    原位合成芯片是指将多个寡核苷酸片段用单核苷酸底物直接合成到载体的特定位置上制备的芯片，主要包括以下几种制备方法。

    1．Affymetrix公司的方法

    它是将光平版印刷技术(photolithographicapproach)运用到DNA合成化学中，利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置确定、高度多样性的化合物集合。该法利用光敏保护基来保护碱基单位的5’羟基。第一步利用光照射使固体表面上的羟基脱保护，然后固体表面与光敏保护基保护、亚磷酰胺活化的碱基单体接触，合成只在那些脱保护基的地方进行。光照区域就是要合成的区域，该过程通过一系列掩膜来控制。如此循环以合成寡核苷酸，直到设定的寡核苷酸长度。每个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因存在于DNA芯片的特定位置上，可合成任意序列15—25个碱基长度的片段。这种方法可使每cm²上的探针数量达到10⁶个，每种探针为5～10btm的方形区域，探针的间距约为20btm。这种方法的最大的优点就是可以在较小的区域内制造大量不同的探针，如1cm2可以有400 000种探针。后来由于运用了非线性半导体光抗技术(non—linear semicondutor photoresist technology)，而使探针的间距更加微小。目前Affymetrix公司已有可以同时检测人类全基因组的表达谱基因芯片及检测高达50万个SNP的基因芯片。

    2．第二种方法

    通过机械手臂直接将碱基合成试剂氨基膦酸酯点样到芯片适当的位置上，循环下去就能合成预计的寡核苷酸。由于这种方法灵活性高，能合成任意寡核苷酸片段，因此有应用潜力。美国Agilent公司便是利用喷墨的原位合成技术合成了60个碱基的寡核苷酸芯片产品。

    3．第三种方法

    用物理方法如掩蔽体来限定前体物质的位置，将前体物通过正交管道只需几步就能合成选定长度的所有相关序列的阵列。还有一种方法，用微型电极矩阵来对特定位置上延伸的寡核苷酸链进行去保护，矩阵与碱基合成试剂的反应使已去保护的寡核苷酸处添加一个碱基，从而得以延伸。这类方法不能在任意位置合成不相关的寡核苷酸，因此只能用于分析DNA多态性等基因型分析，不适合进行基因表达谱的监控。中国东南大学发明了分子印章法原位合成DNA，即采用涂有单核苷酸的印章多次压印在同一位置上。

    4．美国NimbleGen公司的原位合成技术

    用独特的光导合成化学结合无掩膜阵列合成技术(MAS)。MAS系统包括无掩膜的光发射机、反应腔、DNA合成仪和电脑等，系统的核心是一个数码微镜装置(digital micromlrror device，DMD)，创造了虚的掩膜代替传统的物理掩膜。这些“虚的掩膜”能反射紫外光的模式，该模式通过选择性地在精确位置上切割紫外标记的保护基团来去保护新生寡核苷酸，并使下一个碱基加上去。这种方法可以合成长达60个碱基的寡核苷酸片段，一张芯片上可以合成38万个寡核苷酸。