菌落总数检测的注意事项与快速检测技术（一）

引言

食品安全事件的频频发生，使得民众对食品安全问题越来越关注。为了确保食品安全，政府部门除了要出台相关法律法规外，更为重要的是要建立起更为科学的食品安全性的检测技术。规范的检测方法是有效保障食品安全的重要环节，它要求检验数据具有更高的准确度和可信度。食品中菌落总数反映了食品在生产过程中的卫生情况，体现食品被细菌污染的程度，是做出科学卫生评价的重要指标之一[1]。本文主要对国标法微生物检测中菌落总数测定采用的传统方法即平板计数法的注意事项进行相关的分析，并着重介绍了快速检测技术在菌落总数检测中的应用。

一、传统检测方法
 

1 传统检测方法的流程图[2]

2 注意事项
 

  国标法测菌群总数是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。国标法检测应注意以下问题：
 

2.1 所用器皿及稀释液
 

2.1.1 检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。

2.1.2 用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能存在的污染。

2.1.3 检样的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸馏水，但以用磷酸缓冲盐水特别是0.1％蛋白胨水为合适，因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则需采用蒸馏水。
 

2.2 样品稀释
 

2.2.1 检样稀释时,无菌称取(或量取)有代表性的样品25g(或ml)剪碎放于含有225ml灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成1:10的稀释液。制备10倍系列稀释的样品匀液时，每一步都应该摇匀试管或反复吹吸，使菌体能够尽量分散均匀。如系肉、鱼等固体样品，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯中，以8000-10000rpm速度搅拌1分钟，使做成均匀的1：10稀释液。对于像食醋或酸性饮料等酸度较高的样品，如果直接用原样液来检测菌落总数，结果会偏低甚至为0 ，只有严格按标准要求先用灭菌的20-30%碳酸钠溶液将其PH值调至中性后方可准确检测出菌落总数[3]。

2.2.2 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述1：10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。即取1：10稀释液1ml与9ml稀释液混和做成1:100的稀释液，然后依次递增稀释，做成1：1 000、1：10000等稀释液。注意每递增稀释一次，必须另换1支1ml灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。

2.2.3 从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。

2.2.4 在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。   

2.2.5 当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。
 

2.3 平板接种与培养
 

2.3.1 将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作1O倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lml稀释液加入皿内(从皿侧加入，不要揭去皿盖)，最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。每个稀释度应作2个平皿。

2.3.2 培养温度，应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养。培养时间为48±2h。其他食品，如清凉饮料，调味品，糖果、糕点．果脯，酒类(主要为发酵酒)、豆制品和酱腌莱均系用37℃24±2h培养。培养温度和时间之所以有这种不同的区分，是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。
 

2.4 菌落计数
 

2.4.1 在进行菌落计数时，有一些样品的残渣会在视觉上与菌落混淆，因此，在进行计数时应该仔细分辨。菌落的形状相对规则，比较有光泽度，更饱满，而样品的残渣比较不规则，没有菌落的饱满度和光泽度。另外，还可向培养基中添加一定浓度的TTC，可以使菌落成红色，便于观测和计数，但TTC的浓度不宜过高，否则会抑制菌落的生长[4]。

2.4.2 从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。

2.4.3菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报告。

2.4.3.1若1个稀释度的平均菌落数在30—300之间，则将该菌落数乘其稀释倍数报告之。

2.4.3.2若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数。

2.4.3.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

2.4.3.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。