| 实验步骤 |
材料
缓冲液和溶液
各种贮存液，缓冲液的成分及相关试剂请参见附录1
将贮存液稀释至所需的浓度。
甲酸铵（0.2mol/L)
寡核苷酸杂交溶液
6XSSC
5XDenhardt's溶液
106至107dpm/ml放射性标记的寡核苷酸
寡核苷酸预杂交液
6xSSC
5xDenhardt's溶液
0.1%(m/V)SDS
6XSSC
6XSSC应在所需要的温度下顸热，请见步骤 11，12和 13。
TE(pH7.6)
酶和缓冲液
噬菌体T4多核苷酸激酶
限制性内切核酸酶
请见步骤 18 和 19。
凝胶
琼脂糖凝胶
请见步骤 18。
核酸和寡梭苷酸
诱变寡核苷酸（10pmoles/ul)
放射性物质
[γ-32P]ATP(>5000Ci/mmole,10mCi/ml)
培养基
2XYT 顶层琼脂和 2xYT 琼脂平皿
专用设备
钝端镊子（例如，Millipore 镊子）
皮下注射用针头（18 号）和印度墨水（选做）
预杂交用 65°C 孵箱。
适合于杂交溫度的孵箱，请见步骤 7 注释。
硝酸纤维素膜或尼龙膜。
真空烤箱
68°C 水浴
Whatman DEAE 滤纸（DE81)
滤纸贮存在室温，操作时带手套。
其他试剂
本方案步骤 4 需要的试剂列在第 10 章方案 4 中。
本方案步骤14 需要的试剂列在第 3 章方案 4 中。
本方案步骤15 和16 需要的试剂列在第 2 章方案 3,4 或 5 中。
本方案步骤17 需要的试剂列在第 3 章方案 3 中。
本方案步骤 20 需要的试剂列在第 6 章方窠 8和10 中。
载体和细菌菌株
诱变的噬菌体 M13 重组体
请使用方案 2 中产生的含噬菌体 M13 噬菌斑的培养皿。
未经诱变的噬菌体 M13 重组体
用做为阴性对照；请参见步骤 5。
大肠杆菌 TG1 或相应的菌株
方法
用磷酸化反应进行寡核苷酸的放射性标记
1. 在灭菌的微量离心管中混合以下试剂：
诱变寡核苷酸（10pmoles/ul) 1ul
10x 噬菌体 T4 多核苷酸激酶缓冲液 1ul
10mCi/ml[γ-32P]ATP(10~50pmoles) 1ul
水 6ul
5~10 单位/ul 噬菌体多梭苷酸激酶 1ul
混合物于 37°C 孵育 30 min。
2. 加入 90ulTE(pH7.6), 将混合物稀释至 100ul，68°C 加热 10 min 灭活多核苷酸激酶。
3. 测量 32P 转移到寡核苷酸上的效率，按以下过程操作，经 DE81 滤纸层析估计比活。
a. 剪下一条约 1cm 宽，7~10 cm 长的 DE81 滤纸，用软芯铅笔在距离一端 1.5 cm 处划一条平行的细线。标记层析开始的原点。
b.
在原点处点 1.0ul 稀释的磷酸化反应物。在 250 ml 烧杯中加入约 25~50 ml 的 0.2 ml/L 甲酸铵，使其深度达 0.5
cm 左右。将 DE81
滤纸条垂直放在烧杯中，使位于原点的放射性样品刚好在缓冲液上方。用一块玻璃板或铝箔盖住烧杯，使层析逐渐进展直至溶剂迁移的前端接近烧杯顶端。
c. 用莎伦包装膜包裹 DE81 滤纸条，用很短的时间进行放射自显影。以显影的 X 射线胶片为基准，切下溶剂前端带放射性的区域、原点区域和含放射性的其他区域。用液闪计数器测定每一部分的放射性同位素强度。
寡核苷酸保留在原点，而 ATP 和无机磷与溶剂迁移的方向相同。无机碘迁移稍落后于溶剂前沿，而 ATP 位于原点和无机磷之间的同等距离将来自 [γ-32P]ATP 的磷酸转移至寡核苷酸上导致原点出现放射性物质，由寡核苷酸摩尔数计箅出放射性标记探针的比活以及 [γ-32P]ATP 在反应中的比活和将放射性转移至寡核苷酸上的效率。步骤 1 中大于反应混合物 50% 的放射活性应被转移到寡核苷酸上。
4.(可做可不做）按第 10 章方案 4 介绍的过程，用十六烷基溴化吡啶鎓从寡核苷酸中沉淀掉未被结合的放射性物质。
正常情况下，反应混合物可直接用做探针。除非杂交背景持续引起麻烦时，一般不需要进行该步骤。
噬菌体 M13 噬菌斑的筛选
5. 按以下步骤制备用于放射性标记的寡核苷酸探针筛选的噬菌体 M13 噬菌斑的复制物：
a. 把含 100~500 个噬菌斑的培养皿置于 4°C 至少 30 min。至少应包括个含原始野生型重组 M13 噬菌斑的培养皿。该培养皿做为杂交和洗膜步骤中的阴性对照。
b. 当培养皿完全冷透后，从冷室中取出平皿，马上将作为标记的干的硝酸纤维素膜或尼龙膜覆盖于每个平皿的琼脂表面。用一个 18 号针头穿过滤膜和下层琼脂制作一系列洞。这些洞将在后来的步骤中用作滤膜与下层琼脂匹配的标志物。
在针刺滤膜前用针头沾取少量印度墨水可制作成一种擦不掉的标志点。
c.30s 至 4 min 后，用钝端镊子仔细的从培养皿上揭下每一张滤膜。将沾有噬菌斑的滤膜面向上平铺在一叠吸水纸上。用莎伦包装膜包裹培养皿，贮存在 4°C 直到需要。
d. 当滤膜干燥时（室温下大约 30 min)，放在真空千燥箱中 80°C 烘烤 1h。
由于单链 DNA 可在烘烤过程中从噬菌体中释放出来，因此在筛选噬菌体 M13 噬菌斑时不需要用碱对 DNA 进行变性处理。
6.
将所有的滤膜转移至一个可加热封口的塑料袋（例如 Sear seal-A-Meal)
中，或一个直径合适的蒸发皿中，或杂交用滚筒中。加入寡核苷酸预杂交液（在塑料袋或蒸发皿中操作时，82 mmol/L 滤膜加入约 10 ml
预杂交液；在杂交滚筒中操作时，82 mmol/L 滤膜加入约 5 ml 预杂交液)。封上袋口，用莎伦包装膜盖住蒸发皿口或盖上杂交滚筒盖，65°C
孵育 l~2 h。
7. 弃去预杂交液，放入含寡核苷酸探针的杂交液（约 5 ml/82 mmol/L 滤膜)。重新封上袋口，或覆盖蒸发皿，或盖上杂交滚筒。在合适的温度下进行杂交反应 4~6 h。
杂交反应应在低于放射性标记的寡核苷酸 Tm 值 5~10°C 的温度下进行。寡核苷酸的 Tm 值计算公式如下：
Tm=4(G+C)+（A+T)
G+C 是寡核苷酸中 G、C 残基的总数，而 A+T 寡核苷酸中 A、T 残基的总数。
8.
杂交结束后，将滤膜快速转移到含 200~300 ml 的 6XSSC 溶液的盘中。用莎伦包装膜覆盖盘子，室温下在旋转摇床中振荡 15 min,
每隔 5 min 更换洗液。同时将剩余的放射性杂交液从袋子，蒸发皿或滚筒中转移到一个一次性塑料管中. 盖紧瓶口，将放射性溶液贮存在-20°C,
直至重新用于阳性噬菌斑筛选（步骤 13)。
恰当地标记和贮存杂交液。
9.
洗膜结束后，将杂交滤膜快速转移到一张平铺在工作台上的莎伦包装膜膜上。用另外一张莎伦包装膜膜覆盖滤膜。将两张莎伦包装膜膜的边缘折叠封口。把带有放射性物质或荧光墨水的点贴在包裹外面。在使用增感屏的情况下，通常杂交滤膜暴光
X 射线胶片的放射自显影过程需要 1~2 h。
要点：不要使莎伦包装膜上的滤膜干燥。
10. 将杂交滤膜图案与培养皿的噬菌斑分布进行比较，在该步骤中，发现所有的噬菌斑都能与探针杂交是正常的。但某些噬菌斑比另外一些噬菌斑显示出更强的杂交信号，这些噬菌斑通常携带突变体。
11. 将滤膜转移到一个预热到温度比 Tm 值低 10°C 的含 100~200 ml 6XSSC 的塑料盒
中。振荡 2 min(请见下面的注释)，然后按步骤 9 描述的方法将滤膜转移到一张莎伦包装膜上，进行再次放射自显影。这一步往往能鉴定出两种类型的噬菌斑，一种放射性信号强度降低，另一种不发生变化。
如果使用短的（<20bP)
的寡核苷酸探针，不要在低于 Tm 值 10°C
以下的溫度中洗膜超过两分钟。否则的话，放射性寡核苷酸和诱变靶序列间形成的完好的杂交体将解离。长的寡核苷酸探针需要根据经验摸索出的较长的洗膜时间。可用手提式微型放射探测仪监测洗膜过程中放射性信号强度，根据放射性信号强度降低悄况估计出合适的洗膜条件。
12. 重复进行洗膜和放射自显影，每一循环将洗膜溶液的温度提髙 2~10°C。目的是发现能引起错配杂交分子（例如，突变的寡核苷酸和野生型序列）解离，但不影响完全匹配杂交分子的适宜温度。
随着不断实践，通过用手提式微型放射监测仪检测毎次漂洗后的滤膜，省略漂洗和放射自显影的一些次数是可能的。
阳性噬菌斑的纯化
13. 杂交阳性的噬菌斑通常是含有突变体和野生型序列的混合物。因此，需要按以下方法从阳性杂交噬菌斑中纯化噬菌体：
a. 用灭菌的木质一次性牙签的钝端接触阳性杂交噬菌斑表面。
b. 将牙签放入一个含 lml 无菌 TE(pH7.5) 的无菌试管中。将试管置于室温 10~15 min, 不断晃动试管，使噬菌体颗粒脱落在溶液中。
c. 用 TE(pH7.6) 对噬菌体悬液进行 l0x 系列稀释。分别将 10ul 的 10-3,10-4 和 10-5 倍稀释的噬菌体与 100ul 大肠杆菌（例如 TG1) 的过夜培养物混合。
d. 将 2.5 ml2XYT 顶层琼脂（熔化并冷却到 45°C) 加入到每份培养物中，将以上混合物铺在单个 YT 球脂平皿上。37°C 孵育平皿 16 h, 使噬菌斑形成。
e. 用步骤 5~12 描述的放射性标记的寡核苷酸探针重新筛选噬菌斑。在第二轮筛选过程中，不需要逐步增加洗膜溶液的温度。可将滤膜直接从室温转移至预热的 (见步骤 12) 靠经验确定溫度的 6XSSC 中。
14. 从三个杂交阳性突变体中各挑取两个噬菌斑。按第 3 章方案 4 介绍的方法从由噬菌斑衍生而来的被噬菌体感染的小量培养物中制备单链 DNA。
15. 用双脱氧链终止法对含靶序列的 DNA 进行测序（请见第 12 章方案 3 或 4)。可使用测序通用引物，或使用结合在突变位点上游 50~100 个核苷酸的合成引物。
16. 当突变体被确认后，用序列分析方法确证克隆进噬菌体 M13 的靶 DNA 全序列，以确保在噬菌体 M13 重组体的繁殖过程中没有产生意外突变。这一过程通常需要每隔 200~400bp 设计一个与靶 DNA 互补的引物。
17. 对带有所需突变而在靶 DNA 区域没有发现意外突变的重组噬菌斑（步骤 14) 进行纯化后感染细菌，并从感染的培养液中分离复制型噬菌体 M13DNA。分离、纯化复制型噬菌体 M13DNA 的方法请见第 3 章方案 3。
18. 用适当的限制酶消化噬菌体 M13 复制型 DNA 和制备凝胶电泳回收突变的靶 DNA 序列。将靶 DNA 克隆进所需的载体。
19. 用几种不同的限制性内切酶消化重组的未经诱变的靶序列，或消化重组的带有突变的靶序列。
20.
凝胶电泳分离经限制酶消化的 DNA 片段，按第 6 章方案 8 描述的方法将 DNA 转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。用
32P-标记的诱变寡核苷酸作为探针，用低于 Tm 值 10°C 的温度下进行 Southern 杂交。在不同的条件下洗膜并进行放射自显影。
最行一次自显影应仅显示与相关的诱变靶 DNA 片段杂交信号。
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