分离微管和微管相关蛋白实验

PME 缓冲液

匀浆器

1. 收集脑组织（几百克）

(1) 如果从屠宰场取脑（猪）

① 只要美国地方检察官允许，在宰杀后尽快收集脑（猪 )。

② 把脑一个一个地放在薄塑料袋里，立即浸入冰水混合物中，运到实验室。

③ 在冰库里，研究者带着橡胶手套取出脑、表面的血管、血凝块和脑膜。

④ 用剪刀把脑剪成小块（1~2 cm），放到冰浴的小烧杯中。

(2) 如果是买的鸡

① 用锋利的剪刀将鸡断头。

② 将脑取出放到冰浴的烧杯中。

2. 每克脑加 1 ml PME，在一个 50 ml 用马达驱动（3000 r/min）的匀浆器中用研杵上下各 7 次进行匀浆。这种匀浆器是玻璃筒，Teflon 研杵；每次处理 20~25 g。

PME 缓冲液：

0.1 mol/L PIPES，pH 6.9

2 mmol/L EGTA

1 mmol/L MgSO₄

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L GTP

3. 匀浆物在 4℃ 以 40000 g 离心 45 分钟。把上清转移到一个新管中，上清里含冰冷的溶解了的微管蛋白二聚体和微管相关蛋白。

4. 上清在 37℃ 温育 30~45 分钟。

5. 在 25℃ 以 40000 g 离心 30 分钟收集组装了的微管。用一个 Dounce 的匀浆器，用步骤 2 中使用的缓冲液以 1/5~1/4 的体积重悬所得到的微管沉淀物，重悬的微管放到一个干净的离心管中。

6. 在冰/水混和物中冰浴 30 分钟。

7. 在 4℃ 以 40000 g 离心 30 分钟使溶液变清。

8. 步骤 7 中得到的微管蛋白通过重复步骤 4 和 5 再做一轮组装。