SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳仪分析技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（PAGE）分析蛋白质时的迁移率取决于蛋白质分子所带净电荷、分子大小和形状等，如果在PAGE中加入阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此，利用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（SDS－PAGE）可测定蛋白质分子量。

一、工作原理：

SDS是一种阴离子去污剂，带大量的负电荷，在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在，作为变性剂和助溶性试剂能破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键（蛋白质氢键和疏水键）。强还原剂如二硫苏糖醇和β－巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂并不易再氧化，引起蛋白质构象改变。在样品和聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合，形成带负电的蛋白质－SDS聚合物，所带电荷远远超过蛋白质原有的电荷量，消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质－SDS聚合物的形状基本相同，近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比，消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。

因此，蛋白质－SDS复合物在SDS－PAGE中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于蛋白质分子量大小。

二、影响SDS－蛋白质结合的因素：

SDS的作用是去蛋白质电荷、解离蛋白质分子之间的氢键、取消蛋白质分子内的疏水作用和去多肽折叠。

1、溶液中SDS的浓度。

2、样品缓冲液的pH和离子强度。

3、二硫键是否完全被还原。

三、蛋白质分子分子量的计算：

lgM = a－bR_f

式中：a为丙烯酰胺单体的质量，b为交联剂的质量，R_f = 蛋白质染色后的迁移距离/溴酚蓝染色后的迁移距离。

蛋白质分子量的计算：

1、要求有一组标准蛋白质，其分子量应包含被测分子的大小。

2、被测分子的性质和构象与标准蛋白质分子类似。

3、标准蛋白质与被测分子在同一块凝胶上电泳。

4、以标准蛋白质的相对迁移率作横坐标，相应分子量的对数作纵坐标，绘制标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率可在标准曲线上求得分子量。

四、特点：

1、样品无需纯化。

2、测定快速。

3、重复性高。

4、设备简单。

五、应用：

目前测定蛋白质亚基分子量的较好方法。