高效液相色谱仪测定食品中罗丹明B的含量

高效液相色谱仪测定食品中罗丹明B的含量

一、范围

本方法规定了食品中罗丹明B的高效液相色谱仪测定方法本方法适用于半固态调味料、胡椒粉、胡椒油、牛肉干、果脯、干果制品中罗丹明B的测定和确认。

二、原理

样品中的罗丹明B用含酸甲醇水溶液提取，样品通过混合阳离子固相萃取小柱进行纯化，采用高效液相色谱仪荧光检测器进行检测，外部标准方法定量。

三、试剂和材料

除另有规定外，本法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

甲醇（CH3O H）：色谱图纯..

乙腈（c2h3n）：色谱纯。

甲酸(CH2O2)：色谱纯。

氨水（NH₃·H₂O）：色谱纯。

含0.1%甲酸的水溶液：用水稀释1毫升甲酸（3.3）至1000毫升，用滤膜（0.22μm，水相）过滤备用。

50%甲醇溶液：在1L容量瓶中准确测量500mL甲醇（3.1），并用水定容至刻度。

含0.1%甲酸的甲醇水溶液：取1毫升甲酸（3.3）用甲醇水溶液（3.6）稀释至1000毫升。

含0.1%甲酸的乙腈溶液：1 mL甲酸(3.3)，用乙腈(3.2)稀释至1000 mL，过滤(0.22)。有机相)作为后援。

含0.1%甲酸的乙腈水溶液：取0.1毫升甲酸（3.3）和35毫升乙腈（3.2）用水稀释至100毫升，混匀。

5%氨水甲醇溶液：5 mL氨水(3.4)，用甲醇稀释至100 mL，混合均匀（临时使用和当前配置）

罗丹明B标准品： 纯度≥99％。

罗丹明B标准储备液：精密称取罗丹明B标准10mg（精确至0.0001g）置于100mL容量瓶中，用甲醇和体积溶解至刻度，摇匀使标准储备液浓度为100μg/mL将溶液移入试剂瓶，在-18℃黑暗中保存6个月。

中间标准溶液：在100 mL容量瓶中准确移动0.5 mL罗丹明B标准溶液(3.12)，与甲醇混合，浓度为500 ng/mL。避光保存4℃，有效期1个月。

标准工作液：将中间标准溶液(3.13)稀释为0.0ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0 ng/mL，10.0ng/mL，20.0ng/mL，50.0ng/mL标准溶液，加入0.1%甲酸的乙腈(3.9)水溶液。临时使用和准备使用。

混合阳离子固相萃取塔(60mg/3ml)：基质是苯磺酸基聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物或等同物。使用前，依次用3ml甲醇和3ml水活化。

陶瓷均质子。

四、仪器和设备

高效液相色谱仪：配荧光检测器。

旋涡混合器。

离心机：转速8000r/min。

电子天平：灵敏度分别为0.0001g和0.01g。

坐式离心管：50 mL。

组织捣碎机。

固相萃取装置。

五、试样制备与保存

半固态调味料

取适量样品，捣碎，拌匀室温保存备用。

花椒及花椒粉

取适当量的样品，粉碎后再经过40目筛，在室温下保存样品。

花椒油

充分混匀，常温保存备用。

牛肉干

取适量样品，捣碎搅拌均匀，冷藏备用。

蜜饯、水果干制品

取适量样品，捣碎搅拌均匀，冷藏备用。

六、测定步骤

试样前处理

萃取：精密称取2g（香料样品1g，精确至0.01g）于50ml塑料离心管中，精密加入含0.1%甲酸的甲醇水溶液（3.7）10.0ml，混匀，加入两个陶瓷均质子（调味料油样除外），在涡流混合器上涡流15min，以8000r/min离心10min，滤过0.45μm有机相上取3ml萃取液层溶液，待纯化。

纯化：将1.0mL提取液(6.1.1)准确去除进入固相萃取柱(3.15)。固相萃取柱分别以3 mL 0.1%甲酸水溶液(3.5)、3 mL水和3 mL甲醇洗脱。用6ml氨水甲醇溶液（3.10）洗脱目标物质，收集洗脱液。洗脱液在45℃用氮气吹干，残渣用1.0ml 0.1%酸性乙腈水溶液（3.9）溶解（香料样品溶液残渣用0.5ml溶解），用0.22μm有机相滤膜测定。

高效液相色谱仪参考条件

答）色谱柱：C18柱，规格4.6mm×100mm，粒径3.5μm，或性能相同..

B）流动相：A为0.1%甲酸水溶液（3.5），B为乙腈（3.2）。梯度洗脱程序见表2。

(C)流速：1.0 mL/min。

d） 柱温：35℃。

e） 进样量：10 μL。

F）激发波长：550nm；发射波长：580nm。

空白试验

除不加试样外，均按试样同法操作。