自噬双标腺相关病毒说明（二）

(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)

图4 Vigene自噬双标病毒载体图谱

五．Vigene mCherry-GFP-LC3B 自噬双标操作方法

（一）体外实验

以2型AAV病毒为例，Vigene为您推荐的MOI值10⁴-10⁵，是根HEK293细胞得出的数据，不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议您感染目的细胞前，进行预实验摸索最佳MOI值，推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件。

1. 为了节省病毒，推荐使用96孔板进行预实验。

2. 将目的细胞接种于96孔板中，细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好，请保证细胞贴壁过夜。

3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培养基中做1:10稀释（10^-1），以此为起点做梯度稀释直至稀释10^-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

4. 取出提前准备好的96孔板，先确定细胞生长状况是否良好。用准备好的病毒稀释液替代旧培养基，注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。

5. 在加入病毒稀释液后，请在12-24h后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适，是否因为加入的病毒量影响细胞状态。如果细胞没有变化，即所加病毒对细胞没有毒性，可以继续培养。

6. AAV病毒对细胞的感染较慢，请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况。

另：如果您选择的产品没有荧光标签请在96小时以后的不同时间段分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达。

注：由于AAV组织特异性，体外感染细胞的效率比较低，所以我们强烈推荐您购买AAV用于动物实验。

（二）体内实验

针对小鼠/大鼠来说，研究不同的方向有不同的AAV注射方法，详情可查阅Vigene官网。

六．常见问题解答

1.重组AAV 安全吗?

迄今为止，未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV，在无需辅助病毒（如腺病毒）的存在下，复制效率非常低。重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列，因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。

2.哪些血清型的 AAV 可供选择？我该选用哪种AAV呢?

目前为您提供的AAV 血清型为AAV1，AAV2，AAV5，AAV7，AAV6，AAV8 &  AAV9。请参阅下面指南中参考文献的建议。

3.使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表，以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。

rAAV病毒滴度很高，可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。

4.AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体?  

纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后，-80℃下长期保存。

5.订制AAV服务，客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?

您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选，或者提供您的质粒DNA或DNA序列，我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。

基因沉默服务，请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。

通常情况下，可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL。也可根据客户的需要，提供特定体积和滴度的产品。

附：Vigene自噬双标系统感染诱导自噬的HEK293细胞效果图