简介
胰高血糖素样肽-1可诱导胰岛素的葡萄糖依赖性刺激，降低胰高血糖素分泌，可用于2型糖尿病的治疗，但其易被二肽基肽酶-4降解，体内半衰期仅为1h。利拉鲁肽是胰高血糖素样肽-1类似物，其交联到16C脂肪酸残基，促进可逆的自身缔合，并结合至血浆白蛋白，半衰期可延长至13h。
药物的血浆蛋白结合受诸多因素影响，而该过程对于预测药物动力学、药效学及计量-反应关系十分重要，对于延长药物的作用时间也十分关键，所以有必要研究各种因素对结合过程的影响。
超滤是常用的血浆蛋白结合研究方法，适用于不会快速代谢或降解的药物，但疏水性药物会吸附到膜表面，影响定量。常规的平衡透析方法也存在该问题。而本实验使用反复步进式平衡透析方法，定量检测利拉鲁肽的血浆蛋白结合。
实验
利拉鲁肽用放射性同位素标记，以便通过液体闪烁计数方法来定量。利拉鲁肽储液（107 pM）溶于KH缓冲液，然后连续稀释，获得105及103 pM溶液。再以血浆10倍稀释，获得106、104和102 pM溶液。
实验使用15mL Nunc Minisorb 离心管为外室，用利拉鲁肽缓冲液预包被（37℃ 30min，然后过夜），然后将含有特定浓度利拉鲁肽血浆孵育溶液的Spectra/Por 15kD 纤维素酯即用型透析袋放入外室内，37℃搅拌孵育4-5h。孵育结束后，从内室和外室分别取样检测。实验分别测试了利拉鲁肽浓度106、104和102 pM，膜内外浓度比100:1和50:1条件下的药物结合率，并通过测试日内/日间差，评估实验重现性。实验同时检测了利拉鲁肽与人血清白蛋白（HAS）及α1-酸性糖蛋白（AAGP）的结合。
平衡透析实验设置如图所示，两个室内均有利拉鲁肽，以避免其被透析膜捕获。实验在不同跨膜浓度比条件下进行，直到药物过膜流动极低，说明整个系统已达到平衡。
结果
实验日内及日间变异系数分别为0.1%和0.11%，说明具有良好重现性。临床浓度（104pM）利拉鲁肽的蛋白结合率可达98-99%，稀释至102pM不会影响其结合度。HSA是丰度最高的血浆蛋白，而AAGP水平在某些疾病状态下会急剧升高，实验显示104pM利拉鲁肽（膜内/外比为100:1）与两者结合率可达99%。
与大多数血浆蛋白结合药物一样，只有未结合的利拉鲁肽可与效应器作用，产生药理反应。分析显示98-99%的利拉鲁肽可结合至血浆蛋白，亦即在临床相关浓度（104pM）条件下，未结合利拉鲁肽的浓度为100-200pM，与利拉鲁肽半数最大效应浓度相当。如药物的血浆蛋白结合程度发生改变，将会影响其容积分布和清除速率。
血浆蛋白水平的降低会影响利拉鲁肽的蛋白结合，2型糖尿病常伴发肝或肾损伤，导致HSA水平降低或低蛋白血症，但实验显示，利拉鲁肽的药物动力学状态不受其影响。
16C脂肪酰化多肽的亲脂特性使其很难通过超滤法检测血浆蛋白结合，因为会被过滤膜“捕获”。在本实验中，将利拉鲁肽溶于在血浆/蛋白孵育溶液和缓冲孵育溶液中，防止了亲脂性分子被透析膜捕获，此外，对外室进行预包被，防止了药物因吸附到外室表面导致损失，两者结合，保证了利拉鲁肽血浆蛋白结合的准备测量及实验的重现性。
反复步进式平衡透析适用于利拉鲁肽蛋白结合的体外定量检测，结果显示其结合率高约~99%，使其作用期较长的原因。由于血浆蛋白的生理水平相对利拉鲁肽较高，所以结合不会受低疾病状态下的低白蛋白水平影响。该方法将来也可用于检测其它亲脂性药物分子的血浆蛋白结合效应。
详细内容，请参考原文：Plum A., Jensen L. B., Kristensen J. B., In Vitro Protein Binding of Liraglutide in Human Plasma Determined by Reiterated Stepwise Equilibrium Dialysis. Journal of Pharmaceutical Science, 2013, 102(8): 2882 – 2888.
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