简介
在过去的五年中，荧光蛋白在监测体内生物学研究中，起到越来越重要的作用。源于维多利亚多管发光水母中的绿色荧光蛋白(GFP)是最早被我们应用的荧光蛋白，但是随着时间的推移，现在我们可以使用的荧光蛋白种类也越加丰富，包括加强型的变异GFP蛋白、从其他种类水母中发现的荧光蛋白和珊瑚礁蛋白。它们都可以在众多的细胞和组织中被克隆复制，从细菌到酵母，从植物到哺乳动物。这些荧光蛋白稳定、细胞毒性小、而且不需要额外的辅助也能在体内产生可见的荧光。因此，它们可以被用作分子靶标或者独立的报告因子去视化、追踪和定量多种不同的细胞进程，包括细胞合成与代谢，蛋白转运，基因诱导和细胞谱系。不同的荧光蛋白具有不同的颜色，因此也可被用于多重检测。这些荧光蛋白都能被荧光显微镜和流式细胞仪检测到。但是相应的，如果我们不做细胞分选或监测细胞内迁移，具有荧光功能的微孔板读板机将是一个更好、更方便和更高通量的选择。下面，我们将会向大家展示Molecular Devices微孔板读板机如何利用“无创”技术检测活细胞荧光蛋白。我们将从Clontech公司获得的三株HEK-293细胞系进行不同荧光蛋白的稳定转染。这次研究的目的：1）优化三株细胞系的波长设置，2）通过稀释细胞系来确定检测下限LLD，3）证明在一种细胞系中识别另一种细胞系的可行性。
优势
- 简单易用的“无创”技术检测活细胞中荧光蛋白
- 随意可调设置针对每种染料优化最佳波长组合
- 荧光底读检测获得最优结果
材料
- HEK-293细胞系稳定表达三种荧光蛋白：
- AcGFP-多管发光水母中产生的另一种GFP(但不同于维多利亚水母)
- ZsGreen-与GFP相似，但更(来自珊瑚礁)
- DsRed-一种来自珊瑚礁的红色荧光蛋白
- 非转染的HEK-293细胞系，作为对照
- DME: High Glucose(Irvine Scientific cat. #9024)
- G418: Geneticin(Gibco cat. #11811-031)
- FBS (Irvine Scientific cat. #3000A)
- Glutamine/Pen/Strep Solution(Gibco cat. #10378-016)
- Trypsin/EDTA 1X in HBSS(Irvine Scientific cat. #9341)
- 10X Hank’s Balanced Salt Solution(Gibco cat. #14065-056)
- 1M HEPES(Irvine Scientific cat. #9319)
-
HBSS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20 mM HEPES buffer):
Made from 10X Hank’s Balanced Salt Solution (100 mL), 1M HEPES (20 mL)
and water for cell culture (880 mL)
- 细胞培养用水(Irvine Scientific cat. #9312)
- 黑色透明平底96孔板(Corning cat. #3603)或黑色透明平底384孔板（Corning cat. #3712）
方法
细胞准备与分析
细胞都培养在大烧瓶中，应用含10%FBS+1%Pen/Strep/L-glutamine+500μg/mLG418的DMEM的培养基。没有转染的HEK-297细胞作为对照。在实验前一夜，对细胞进行胰酶消化，然后进行密度梯度稀释，最终密度范围为从500,000到100个细胞每毫升。然后把它们过夜接种到96孔(100ul)和384孔(25ul)板中。因此，接种的细胞密度就是50,000到10个细胞每孔(96孔板)和12,500到2.5个细胞每孔(384孔板)。每个稀释都做12个重复。第二天分别用SpectraMaxM5和GeminiEM两台仪器对微孔板进行底读和顶读检测。
波长优化
SpectraMax M5和Gemini EM都是基于单色器的扫描式具有荧光功能的微孔板读板机。针对每一个特殊荧光染料，其激发波长和发射波长都可以在背景之上进行信号优化，这点也是滤光片式微孔板读板机所不具备的。总的来说，优化策略就是：用低于理论最大激发波长20-25nm的激发光激发，然后初扫发射波长；其次用高于理论最大发射波长20-25nm的发射光扫激发波长。扫描后将给出实际的激发与发射波长。最后可以结合信号/背景分析再做其他额外的扫描来确定最终的结果。(根据斯托克顿位移理论，激发波长应该更低、发射波长应该更高，并且需要一个发射光阻隔滤片来隔离掉非目的波长的光信号)。而且可能还会因为要选择最佳阻隔滤片而再进行两次扫描。
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