结果
波长优化
用GeminiEM对DsRed进行波长扫描，以此举例如何进行波长优化。为了检测最大激发波长，我们首先固定发射波长为600nm，然后对发射波长进行扫描。扫描结果显示最大激发波长为556nm(图1)。同样为了检测最大发射波长，我们固定激发波长为535nm，然后扫描发射波长，从而得到584nm的结果(图2)。激发与发射值都与被发表的波长结果557/579相近。
下一步就是要结合信号/背景优化结果确定最佳激发和发射波长。因为初步检测结果的斯托克位移偏小(22nm)，显然是要通过降低激发波长和增大发射波长来扩大两者之间的差异，其次还需要找到合适的发射光阻隔滤片优化最佳灵敏度。最终，我们使用550nm的激发波长来激发，同时使用570nm的发射光阻隔滤片隔离掉不想要的高于570nm以上的激发光。通过575到600nm的发射波长扫描DsRed转染的细胞，结果显示在587-588nm处会有峰值出现(图3，上面的曲线)。背景(没有转染的细胞)区域中，点就相对比较平缓(图3，下面的曲线)。基于本次扫描，我们最终优化的设置为550nm激发、588nm发射、575nm作为发射光阻隔滤片。
观察到的最大值与我们建议用于定性分析的设置都总结在列表1中。
细胞稀释的结果
采用底读得到的细胞稀释结果详见图4(96孔板)和图5(384孔板)。顶读结果详见图6(96孔板)和图7(384孔板)。ZsGreen细胞系(上面的曲线)的亮度是其它两种细胞系的将近3.5倍。尽管DsRed细胞系的结果暗于ZsGreen，但两种细胞系的检测灵敏度却相近(列表2的下图)，因为背景值低于DsRed的波长。总的来说，图中的点稍微有些非线性，最上方会有一点下降。我们推断是因为细胞在高浓度时，会有贴壁生长的趋势，所以会造成非线性的结果。
列表2给出了所有细胞系确认得到的检测下限LLD。其中LLD的计算方法是：3*SDBLANK/Slope，SDBLANK是背景孔(没有细胞的培养基)的标准差，Slope是曲线底部的斜率。(对于96孔板和384孔板，分别使用了10,000个细胞每孔和2500个细胞每孔的数据)。非转染细胞的RFU信号和标准差结果都与只含有培养基的结果相似。
在本次实验中，ZsGreen和DsRed细胞系在底读模式都有着相似的检测限，而且两者都比AcGFP细胞系的检测下限低3到4倍。本次实验一共重复了三次，但是DsRed实验结果并不是每次都能表现的足够好。在一次实验中，它的检测下限近似于AcGFP，但是在另一次实验中，它的检测下限又会很高。我们将这些区别归结于不同细胞系的通道数目不同。(伴随着一个成功的通道，细胞就会变得越暗)DsRed细胞系在实验开始阶段比其它细胞系长得快，所以在第一次实验中，它比其它细胞系多2-4倍的通道，结果就显然不够理想。
对于AcGFP和ZsGreen细胞系，当采用顶读时，检测下限升高将近三倍。另一方面，对于DsRed，当采用顶读时，检测下限会升高将近10-20倍。我们认为造成这种灵敏度下降的原因在于DMEM培养基有红色荧光信号，会对结果有内部干扰。事实也证明，将培养基换成无色的HBSS，相应的DsRed的顶读结果也会变好。列表3展示了将有色培养基换成无色培养基的结果。底读并没有太多改变(尽管AcGFP的检测下限看起来改善了)，证明这种操作方法并没有导致细胞的损失。然而顶读结果却让灵敏度改善了将近三倍。这些结果也从某一方面支持了一种理论，那就是有色培养基会一定程度上影响顶读的灵敏度。
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