在现代医学中，输血是出血性休克、贫血等病症重要的治疗方法，也是常规手术的重要组成部分，但是肝炎及AIDS等小概率传播风险，总是干扰着输血的安全进行。此外，输血前，还需对供体血液进行分型，并与受体血型交叉匹配，以避免出现排异现象。
对此，一种相对简便的替代方法是，使用血红蛋白（Hb）类氧载体（HBOCs）取代供体红细胞（RBCs），其具有以下优点：首先，由于HBOCs表面没有血型抗原，一般不会引起排异现象；其次，在Hb纯化过程中灭活并清除了病毒，所以大大降低了血源性疾病传播的可能性。
Hb通常从人或牛RBCs（hRBCs或bRBCs）中提取。对纯化的Hb进行化学修饰是HBOCs合成的一种主要途径，化学修饰型HBOCs可以通过分子内交联Hb、聚合Hb或将聚合物结合到Hb表面的方法来完成。Hb也可以包埋到固体或中空颗粒内部，以形成非化学修饰型HBOCs。
从裂解的RBCs中提取并纯化Hb前，需先去除血液中的白细胞、血小板及血浆成分，可先离心并漂洗血液，以分离血浆和白细胞层。所得的RBCs再用低渗溶液孵育裂解。
从RBC裂解液中纯化Hb的方法有很多种，包括有机溶液萃取以及离子交换层析分离。层析方法又可以大体归类为吸附方法（Hb被截留在固相介质内，然后溶剂洗脱）或流穿方法（杂质被截留，而Hb被洗脱）。流穿方法消除了吸附和洗脱过程，但与吸附方法相比，所得的Hb纯度较低。不过，两种方法都受到血细胞裂解方法及裂解状态的影响。
在还原剂存在的绝氧条件下进行加热，也可以进行Hb的纯化。在该过程中热敏感性蛋白选择性沉淀，而病毒被灭活，但Hb也有可能因为高温而失活，所以需要添加稳定剂，以防止Hb变性。
过滤也是Hb纯化的常用技术，可有效降低Hb溶液中的病毒载量。但是常规的过滤技术通常需要配合化学修饰和分馏操作，以从未修饰型Hb和其它杂质中分离修饰型Hb，且由于细胞碎片堵塞膜孔，造成流速降低。针对这些问题，本文将介绍一种多阶段式过滤方法。在该方法中，大多数细胞碎片在第一阶段（膜MWCO 50nm）被清除，然后连续过滤，逐步清除较大的细胞碎片和分子。该技术相对简单，且可同时进行Hb的纯化和浓缩。
KrosFlo Research 2i [KR2i] 切向流过滤系统
材料 & 方法
RBCs溶液起始处理量为1,000mL，离心后，用等渗盐水漂洗去除非细胞性Hb和血浆蛋白，再用PB溶液冰浴裂解RBCs，裂解液终体积为2,000 mL。
仪器使用KrosFlo 研发用IIi 切向流过滤系统和4根不同孔径规格的中空纤维过滤组件：50nm、500kD、100kD和50kD，级联流路如下图所示。组件使用前用去离子水完全浸湿，并进行完整性测试。
多阶段中空纤维过滤系统示意图
在每个过滤阶段，收集滤液，并循环回流液，以提高Hb产量。但在阶段III，1L的PB溶液进行洗滤操作。整个纯化工艺在生物安全柜内进行，滤液及回流液容器置于冰上。每个阶段开始和结束时测量滤液流速和跨膜压，并在各阶段处理结束后，从滤液中取出10mL，做进一步分析。阶段I起始过滤量为2,000 mL RBCs裂解液。每次运行结束后，HF组件、相关软管和容器均用0.5M NaOH溶液清洗，以清除可能粘附到HF膜上的蛋白，并降解可能存在的内毒素。
使用Bradford、紫外可见光谱、质谱等方法对纯化所得的Hb进行质量检测。
结果 & 讨论
由于浓差极化的原因，在Hb纯化的每个阶段，滤液流速和回流液体积都会随时间降低。浓差极化是由于大分子或颗粒积聚在HF膜表面，形成滤饼层，即使在HF膜没有发生物理性堵塞的情况下，滤饼层的形成也会降低分子穿过膜的速率。在前两个阶段，大部分蛋白质通过HF膜，进入滤液容器，而细胞碎片和大分子则浓缩回流，部分细胞碎片会堵塞HF膜孔，提高跨膜压，降低流速。在阶段III，大部分Hb被截留在回流液中，而部分Hb（αβ二聚体）进入滤液。
蛋白浓度分析显示，大部分Hb截留在阶段III（膜MWCO 100kD）的回流液中，浓度约为5mM，显著高于离子交换层析方法（0.7 - 1.7mM），而metHb水平（~ 0.5%）低于离子交换层析方法（0.5% - 2%）。纯化的Hb中，内毒素水平亦低于RBCs原液，内毒素主要为脂多糖（~ 10kD），可在阶段III（100kD HF膜）过滤去除。
SDS-PAGE显示，大多数杂质在阶段I和II即可去除，而在阶段III，通过连续洗滤，可显著降低杂质含量。在平衡氧结合特性分析中，纯化的Hb（100 kD回流液）各测量值均与RBCs接近，说明TFF过程未改变Hb特性。
对阶段III回流液内容物进行质谱检测，结果显示，α、β球蛋白链及其聚合物分子量检测值与理论值保持一致，说明Hb是阶段III回流液中的主要成分。
切向流过滤是一种实用、快速的Hb纯化及浓缩方法，与其它方法相比，所得Hb纯度较高，且metHb水平较低。同时，调整阶段III的洗滤体积，可进一步提高Hb纯度。
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