高架十字迷宫实验相关-紫果西番莲叶提取物抗焦虑作用及其机制
摘要目的探讨紫果西番莲叶提取物的抗焦虑作用及其机制。方法60只小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组和提取物大、中、小剂量组共5组。提取物大、中、小剂量组分别灌胃紫果西番莲提取物800，400，200 mg·kg～·d～，阳性对照组给予地西泮2 zng·kg～·d～，空白对照组灌胃等容积1％羧甲基纤维素钠，各组连续给药7 d。以高架十字迷宫(EPM)实验为动物模型，考察紫果西番莲叶的抗焦虑活性；用聚合酶链反应(PCR)法对扩增产物进行分析。结果紫果西番莲叶醇提物(400，800 rng·kg-。·d-1)能增加小鼠在开臂内运动时间和次数百分率，并且提高小鼠在开场中央区的次数；实时荧光定量PCR法分析表明，紫果西番莲叶醇提物(400，800 rng·kg一·d_1)能上调EPM焦虑小鼠脑组织中GABAA受体0【，亚型和0【，亚型mRNA表达水平。结论 紫果西番莲叶醇提物具有明显的抗焦虑作用，其作用机制可能与调节GABA^受体d2亚型和仅，亚型mRNA表达水平有关。
关键词紫果西番莲叶；焦虑；高架十字迷宫；1一氨基丁酸A型受体
紫果西番莲(P．edu纭Si琊)，别名百香果，为西番莲科(P0ss坍omce口e)西番莲属(几黜耖％m L．)藤本植物，目前在我国台湾、广东、福建、广西和云南等省区均大量栽培。西番莲全草均可人药，对于神经痛、一般性癫痫发作、癔病、间歇性哮喘、更年期综合征、心律失常、高血压有很好的疗效。在热带国家普遍用作民间治疗用药，在欧洲更是颇负盛名，适用于治疗睡眠失调和焦虑不安等多种疾病，然而笔者尚未见国内紫果西番莲抗焦虑作用的研究报道。由此，笔者在本研究对紫果西番莲叶的抗焦虑作用进行实验研究。
1材料与方法
1．1动物健康雄性昆明种小鼠60只，级别：sPF，初始体质量20～25 g，合格证号：scxK(粤)2008旬002，购自广东省医学实验动物中心。小鼠饲养于广州军区广州总医院动物实验室sPF动物房。光照节律12L：12D(7：00～19：oo)，室温(18±2)℃，相对湿度约50％，动物可以自行摄取标准饲料和清洁饮用水。
1．2 药物与试剂 紫果西番莲叶采自广东梅州五华县，经华南植物研究所韦强老师鉴定为西番莲属西番莲科植物紫果西番莲(P∞s汐om edu玩Si郴)的干燥叶；羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose，cMc)；地西泮(上海信谊医药公司，批号：10021122)；Trizol试剂(TaKaRa Code：D9108A)；焦碳酸二乙酯(DEPc，广州威佳科技有限公司)；D12000 DNAMarker(大连宝生物有限公司)；EB溶液(上海申能博彩生物公司)；M．MLV逆转录酶(nvitrogen)；sYBRPremix Ex Taq’M(TaKaRa)；Loading Bufkr(TaKaRa)。引物合成和测序由上海捷瑞生物科技公司完成。
1．3仪器小鼠高架十字迷宫(由上海欣软信息科技有限公司提供)；NAN0 DROP 2000；恒压电泳仪(北京六一仪器厂)；恒温水浴槽(上海精宏实验设备公司)；GeneQ基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)；荧光定量PcR仪(Qiage n、公司)；凝胶成像系统(universal Hood)Ⅱ(Bio-Rad公司)。
1．4溶液的制备取紫果西番莲叶粗粉160 g，用15倍量的60％乙醇80℃回流提取3次，每次2 h，合并滤液，滤液经旋转蒸发减压干燥得紫果西番莲叶醇提物，临用前用1％CMc进行溶解。地西泮用1％CMc配成o．125 mg·mL‘1溶液，4℃保存，使用前混摇均匀。
1．5动物分组与给药方法将小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组和紫果西番莲提取物大、中、小剂量组共5组。其中紫果西番莲提取物大、中、小剂量组分别按800，400，200 mg·k～·d。1灌胃给药¨1，阳性对照组给予地西泮2 mg·kg～·d～，空白对照组灌服等容积1％cMc。各组连续给药7 d，于第7天在末次给药1 h后8：00～16：00进行行为测试。
1．6 小鼠高架十字迷宫(EMP)实验高架十字迷宫包括两个开臂(长30 cm，宽5 cm)与两个闭臂(长30 cm，宽5 cm，高15 cm)距地面50 cm。迷宫测试前将每只小鼠放人一个50 cm×50 cm×40 cm旷场箱中，任其自由探究5 min后迅速置于EPM的中央平台处，使其头部正对其中1个开放臂，记录5 min内小鼠进入开臂次数、闭臂次数和迷宫中央区内的次数及在开臂与闭臂的运动时间。以进人开臂次数与总入臂次数的百分率及在开臂内运动时间与人臂总时间百分率代表抗焦虑作用指标。整个行为过程用Supermaze软件实时分析实时监测。每测试完一只用湿布擦拭迷宫，清除粪便，用干布擦拭干净后再进行下一只小鼠的测试。
1．7 鼠脑组织中1一氨基丁酸A型(GABA。)受体仅2和仅，亚型mRNA表达的检测 小鼠EPM行为学测试结束后，立即处死，每组分别取5只小鼠的脑组织，无菌条件下分离全脑，将脑组织置于预冷的研钵中，在液氮条件下捣碎成粉末，按试剂盒说明用TRIz01试剂提取脑组织总RNA，用1％琼脂糖凝胶电泳来鉴定RNA的完整性后，用半定量RT—PcR方法检测GABA。受体d：亚型和0【，亚型mRNA水平的表达，以B—actin作为内参照，仅2亚型上游引物5’一GcTAcGC吼～C—ACAACCTC一3’，下游弓I物5 7一TCA7ITGAC711ACACT—C1Trcc．3’；o【，亚型上游引物5’．CAACTAC rITIICACcAAGCGG．3 7，下游弓l物5’．CGGGAAATrITGTCAACCT一37；PcR反应条件：94℃5 min预变性，94℃30 s，53．6℃30 s，72℃45 s，扩增38个循环，72℃延伸7 min，PcR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳。Real—timePcR 分析：仅：亚型上游引物 5 7一AATcT—GGACTCCTGA‘rACCTTC．3’，下游弓I物5 7一CATTCGGcTTGGAcTGTAAG一3 7；d，亚型上游引物5’一AAGT—GCACAGGATGGCTCACG一3’，下游弓l物5’一ACATGG—CAAGTAGGTCTGGATGAC-3 7；Real-time PCR反应结束后，应用PcR仪软件分析反应结果，检测各样本中的c。值，以Delta—delta c。法分析各组GABA。受体仅2亚型和仪，亚型基因相对表达量。
1．8统计学方法 应用sPSsl8．o版for windows统计软件包对数据进行统计分析，实验数据用均数±标准差(孑±s)表示，采用单因素方差分析(one—wayANOVA)进行检验。P<o．05为差异有统计学意义。
3讨论
紫果西番莲在巴西民间作为治疗焦虑症的药物，文献研究表明，紫果西番莲提取物与地西泮的不同之处是在抗焦虑的同时，不阻断记忆过程。本研究采用RT—PCR和Real-time PCR两种方法对紫果西番莲叶提取物是否通过GABA。型受体仅：亚型和仅，亚型来发挥抗焦虑作用进行了探讨，结果显示800及400 mg·kg～·d一的紫果西番莲叶提取物相对于空白对照组，仅：亚型和仪，亚型mRNA的相对表达量差异有统计学意义(P<0．01)，提示紫果西番莲提取物的抗焦虑作用与GABA．型受体有关。
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