简介
生物体的激酶组是其基因组中的一组蛋白质激酶，这些蛋白修饰酶是很多治疗领域的潜在靶标。 近年来关于表征人类激酶组的研究和对可用激酶晶体结构的探索导致对激酶作为药物干预潜在靶标的关注日益增加。
自从制药行业在 20 世纪 80 年代末开始关注激酶起，研发的大多数激酶抑制剂都以酶的ATP 结合位点为靶标。 然而，Gleevec™ 的研发为此领域的研究注入了新的活力，该药物是一种酪氨酸激酶抑制剂，可诱导靶标 BCR-Abl 激酶发生结构重组。 这引发了关于处理激酶抑制的创新理念，包括在 ATP 位点外部结合和尝试防止激酶活化。
详细的酶动力学研究在基于新颖理念表征化合物作用机制中起着不可或缺的作用。 一种具有极高价值的方法是等温滴定量热法 (ITC)，该方法可提供化合物与靶蛋白结合的完整热力学资料。 使用该方法产生的数据可对比化合物与不同形式的酶结合的亲和力测定，例如游离酶、酶-底物复合物、酶-产物复合物、活性和非活性酶。
酶信号传导抑制在肿瘤和炎症领域是久经考验的疾病治疗方法。 我们已经知道，ITC 可提供信息确定其他配体是否对酶的生物活性有影响，因此本应用报告主要阐述了 ITC 如何应用于鉴定可赋予这一生物活性的酶的分子间复合物。
ITC 概述
等温滴定量热法可在一次实验中测定结合作用的很多个特性，包括亲和力 (KD)、配体结合位点的数量 (n) 以及结合反应的焓 (ΔH)。 该方法速度很快，不需要荧光标记，且可用于研究没有催化活性的蛋白质（这些蛋白质因催化活性的缺失而被排除在酶动力学分析的研究之外）。
ITC 实验通常涉及在恒定温度下对靶蛋白滴定实验化合物，使用 ITC 仪器测定结合活动期间释放或吸收的热量。 在针对蛋白激酶的药物研发期间可以多种途径使用此方法。
其中包括：
• 蛋白质结构表征和制备，不仅仅是模型配体正确的亲和力方面，还包括正确的化学计量，从而帮助评估功能蛋白质的量，而无需催化活性
• 分析评价
• 鉴定可赋予生物活性的分子间复合物，ITC 可提供信息来确定其他配体是否会对试验化合物的生物活性产生影响，这正是本应用报告关注的焦点。
靶蛋白质量控制
在进行机理研究前，对靶蛋白进行质量控制检查即使不是必须的，也是非常有用的。 应通过验证蛋白质的特性、纯度、浓度、功能性和稳定性进行质量控制。
在其中两个重要领域可使用量热法。 ITC 被用于通过对比滴定已知配体获得的亲和力和化学计量与一系列靶蛋白文献数据验证靶蛋白的功能性。 与之相关的差示扫描量热法(DSC) 技术被用于验证蛋白质的熔解温度，Tm ，远高于实验温度。 分离的激酶域常常只有部分稳定，Tm 值约为 40°C（图 1）。 从长远来看，在开始详细机理研究前使用这些方法来表征靶蛋白可节省时间和成本，有助于避免因蛋白质质量差产生不真实或具有误导性的结果。 激酶域的熔解温度低可能指示稳定性低，突出了对改善纯化标准、储存或分析条件的需求。
图 1：在配体结合研究前使用 DSC 研究蛋白质的稳定性。 红线是 DSC 数据。 蓝线是去折叠模型的最佳拟合线。
了解作用机制
有关其他配体是否对试验化合物生物活性有影响的信息对于药物研发非常重要。 第二配体可能：对试验化合物的活性没有影响；直接或间接与化合物的结合竞争；或者试验化合物发挥功效需要此配体。
了解试验化合物的作用机制对解释或预测底物浓度与测定 IC50 值所用浓度不同时细胞的活性非常有用。 这还有助于了解 3D 结构的相关性，对于不同的分子间复合物可解析其3D 结构。 有关作用机制的信息还可用于设计以特定分子间复合物为靶标的后续分析。
激酶抑制剂倾向于结合或诱导激酶蛋白质的非活性构象。 对比各个形式的试验化合物的结合亲和力也有助于确定是否要继续研发与活性或非活性形式的蛋白质结合的化合物。这种类型的决策将影响后面涉及激酶药物研发的工艺。
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