ITC 结果清楚地显示，当检测池中的蛋白样品包含 ATP 时，化合物结合激酶的亲和力没有变化。 焓值指示尽管对亲和力没有影响，但是对结合的焓有显著影响。 因此这些结果表明，该化合物在 ATP 结合方面是非竞争性的，而在存在 ATP 时结合模式可能有些变化。 这不仅强调了 ITC 在表征化合物结合的详细机制中是有用的，而且突出了这种技术在亲和力和结合焓测量中的双探测性质。 在一个类似实验中，对于与相同蛋白质激酶结合的不同试验化合物，观察到其在 ATP 方面的抗竞争动力学。 在不存在 ATP 时 KD值大于 50 μM（在标准 ITC 试验中是不可测量的），而在存在 ATP 时 Kd 测量值为 0.7 μM （图 4）。
图 4：抗竞争性抑制剂结合滴定。 试验化合物与蛋白质激酶和 ATP 的复合物结合的滴定。 参数值为 KD =0.56 μM，.H = -2.3 kcal/mol，n = 1.4。 在不存在 ATP 时没有观察到结合。
另一个实验也显示了能够直接监测与单个蛋白质复合物结合的优点，在这里我们猜想化合物对一个信号通路中的两个相邻激酶的复合物有高亲和力。 ITC 允许要研究的化合物单独结合上游激酶，也可以结合上游和下游激酶的复合物，前提是先证明的确形成了该复合物。 对于化合物与复合物的结合，经证实亲和力有 5 倍的增加（图 5）。
图 5：化合物结合上游激酶（红线）以及结合这个激酶与其下游底物激酶复合物（蓝线）的比较。 对于与复合物的结合，证明亲和力有 5 倍的增加。
总结
量热法已经被证明在蛋白质激酶抑制研究中具有十分宝贵价值。 该方法可以促进靶蛋白的质量控制检查以及有助于抑制剂结合机制的详细研究。
高通量和自动化仪器的出现为这些应用增加了价值，例如 Malvern MicroCal AutoiTC200和 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 系统。 而向更少的试剂消耗方向的努力将确保量热法广泛应用在合理的药物设计过程中。
作者致谢
Geoff Holdgate，Astra Zeneca Pharmaceuticals（英国麦克尔斯菲尔德阿尔德利公园梅勒塞德，SK10 4TG）全球化合物科学、先导物生成-研发能力与科学部门首席科学家
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