治疗用生物分子必须以具有活性的原生形式保持稳定，直到向病人给药并输送到作用部位。 在初期对生物药剂进行稳定性筛选有助于确保进一步研究集中在最有可能用于进一步药物研发的制剂上。 差示扫描量热法 (DSC) 可用于快速确定蛋白质制剂稳定性的最佳溶液条件，有助于确定最佳候选制剂并加速研发过程。 本应用报告对 Malvern MicroCal DSC 技术和其在制剂研发中的使用进行了说明。
简介
生物药剂研发中一个较早的决定是确定生物药剂将以液体还是冻干粉的形式提供。 一般而言，液体制剂生产成本较低，更易于使用，但需要在冷藏条件下储存，且稳定性较差。 冻干蛋白质生产成本较高，且在向病人给药前需要溶解，但是其可以在室温条件下存放，且稳定性较高。 方便最终用户也是需要考虑的因素[1,2]。 制剂科学家必须确定溶液中的蛋白质是否能在足够的时间段内保持稳定性，还是只能以冻干形式保持稳定。
水溶液中的蛋白质处于天然（折叠）和变性（去折叠）构象之间的平衡状态。 疏水作用和氢键结合是主要的稳定力，是蛋白质去折叠和变性必须克服的力。 构象熵会削弱稳定力，因而允许生物聚合物去折叠[3]。蛋白质在加热或变性化学物（例如十二烷基硫酸钠和盐酸胍）被添加到溶液中时发生去折叠。 变性的蛋白质更易于[4~7]发生不可逆的化学过程，例如蛋白质水解[8]、氧化[9]和脱酰胺[10]，继而导致失活。 变性的蛋白质还更容易发生聚合，而且聚合会导致稳定性下降和蛋白质分解[11~14]。
在研发制剂前，必须对蛋白质进行表征。 这包括确定其分子量、氨基酸组成、三维结构、是否存在二硫键、糖基化反应、辅因子要求、抑制因子、溶解度、热力学参数、功能性、等电点、疏水性和表面面积。 所有这些信息对设计蛋白质的最佳制剂而言都非常重要。 通过使用合理的药物设计方法，经过生物工程改造的蛋白质也可改造为在所选溶液中保持最高的稳定性和最大的功效。
蛋白质的液体制剂应有助于在生产、包装、储存和运输期间保持生物聚合物的稳定性和生物活性，直至最终输送到病人体内的靶部位。 在制剂研发过程中需要考虑的参数包括浓度、是否存在添加剂（辅料）、pH、储存温度、容器以及光、空气和湿度的曝露程度。
制剂研发过程中涉及的另一个因素是药物输送机制。 例如，通过静脉注射输送的生物药剂须为可稀释的，如果该蛋白质不易溶，其会在病人血液中沉淀。 此外，如果是注射药物，则制剂的成分不可对病人造成组织损伤或疼痛。 另一点需要考虑的是容器或装置表面（注射器、泵等）可能会吸收蛋白质。
蛋白质的稳定性通常使用各种分析方法确定，包括加速和实时稳定性研究。 通常还会评估聚合/沉淀的程度、氧化、蛋白降解和/或二硫键重排。 对运输条件进行测试，以确保药物在输送时不会失去生物活性。
DSC 和制剂研发
差示扫描量热法 (DSC) 是用于直接以天然形式表征生物分子稳定性的微量热法。 该方法通过测量在以恒定速率加热时与分子热变性相关的热能改变测定稳定性。 测定热跃迁中点 (Tm) 可提供快速、简易的稳定性指示。 Tm 值越大，生物分子越稳定。
DSC 仪器上配备含有生物分子与缓冲液的样品池以及一个只有缓冲液的参比池。 接通加热器电源，以恒定速率提高样品池和参比池的温度。 在温度升高时，仪器监控样品池和参比池之间的温度差别。 两个池维持相同温度所需吸收的热量差决定了表观过剩热容（图 1）。 焓变跃迁的温度中点 (Tm) 发生在蛋白质从天然形式变为变性形式时。 在达到 Tm 时，50% 的蛋白质处于天然状态，50% 处于变性状态，呈现两态跃迁（图 1）。
有些拥有不同活性区或多个结构域的蛋白质可以有多个 Tm。 科学家可以重点研究一个或两个因配方改变而表现出最大影响的 Tm 值。
Tm 是热稳定性的指标，一般而言，Tm 越高，蛋白质越稳定。 Tm 越高，蛋白质在低温环境中也越不容易去折叠和变性。 通过探索各种条件和添加剂，DSC 可确定具有最高Tm 的制剂，这就相当于稳定性最佳的制剂 [4,5,7,15,16]。
在化学过程中，要么释放热量（放热），要么吸收热量（吸热）。 蛋白质从天然转变到变性的跃迁过程通常是吸热的。 构象跃迁期间的焓 (ΔH) 变化是通过对跃迁下方的区域进行积分来测定（图 1）。 变性蛋白质的热容 (Cp) 通常比天然蛋白质的高，从而导致热变性的 ΔCp 为正（图 1）。
图 1：典型的 DSC 热分析图。 该 DSC 扫描在稀释蛋白质溶液上进行，该蛋白质从低温下的紧凑、天然状态跃迁到高温的去折叠、变性状态。 蛋白质的表观过量热容根据蛋白质在缓冲液中的热容与单独缓冲液的热容之间的差别测定。 使用非线性最小二乘回归分析将数据与两态跃迁模型拟合，从而计算跃迁的 Tm、ΔH 和 ΔCp。
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