在研究溶液中的生物聚合物时使用 Malvern MicroCal™ VP-Capillary DSC(图 2)和Malvern MicroCal VP-DSC 系统。 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 系统专为筛选多个制剂的 Tm 设计,可实现较高的样品处理量(24 h 内最高处理 50 个样品),同时扫描速率很快(最高 250°C/h)。 完全一体化的自动进样器允许无人照看操作。 有关Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 和 Malvern MicroCal VP-DSC 系统的特点对比,请参见表 1。
图 2:Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 系统。
表 1:Malvern MicroCal VP-DSC 和 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 系统对比
MicroCal VP-DSC | MicroCal VP-Capillary DSC | |
活性池容量 | 500 μl | 130 μl |
通常所需的最低蛋白质浓度 | 0.02 至 0.1 mg/ml | 0.2 至 0.5 mg/ml (Tm)> 1.5 mg/ml(ΔCp 和 ΔH) |
最大扫描速率 | 90°C/h | 250°C/h |
温度范围 | -10°C 至 130°C | -10°C 至 130°C |
通常每次扫描的时间 | 60 至 150 min | 35 至 55 min(取决 于扫描速率和温度) |
每天的最大扫描量 | 4 至 6(手动),8 h 内 | ~50(无人照看),24 h 内 |
自动灌注和清洗池 | 否 | 是 |
每个 96 孔板的样品 | 不可用 | 48 |
液体制剂策略
在制剂研发中,主要的问题是确定何种溶液条件可以为天然蛋白质提供最大的稳定作用。 产生最高 Tm 的条件通常使蛋白质在最长的时间内以及在低温环境中保持在天然状态。 首先使用 DSC 筛选不同的 pH 和缓冲液条件,然后筛选辅料和防腐剂。
缓冲液和 pH 优化
图 3 显示了蛋白质 CD40L 的 Tm 与 pH 的函数关系。 此外还测定了在 37°C 环境中存储 7 天后 CD40L 的聚合情况。Tm 最佳的 pH 条件与在聚合程度最低时的 pH 条件相一致[16]。 在对巨噬细胞集落刺激因子的研究中也看到 pH、Tm 和聚合之间的这一关联性[4]。
图 3:CD40 配体 (CD40L) 的稳定性行为与 pH 作图,将 (A) 通过尺寸排阻色谱 (SEC) 确定的聚合响应和 (B) 通过 DSC 测定的 Tm 关联起来。 括起来的区域代表 Tm 最大且聚合程度最低时的最佳 pH 范围。 资料来自参考文献[16]。
通过 DSC 测定蛋白质 Tm 的变化是相对简单的过程。 图 4 显示了当 pH 增加时,胰凝乳蛋白酶原的 Tm 变化,使用 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 测定。 Tm 随 pH 增加而增加,这指示 pH 较高时天然形式的胰凝乳蛋白酶原稳定性更高。
图 4:胰凝乳蛋白酶原的 Tm 随 pH 变化。 制备胰凝乳蛋白酶原溶液(pH 1.96、2.27、2.57 和 3.02)并添加到 96 孔板中。 每个 pH 使用五个样品。 相匹配的的参照缓冲液也放在 96 孔板中。 使用 Malvern MicroCal VPCapillaryDSC 进行 DSC 扫描。 此处所示的数据已去除参照缓冲液背景。 图中有各 pH 的 Tm 数据和标准偏差。