辅料
辅料是可提高蛋白质稳定性的添加剂。 它们包括糖、氨基酸、抗氧化剂、聚合物、酒精、丙三醇和表面活性剂。
确定最佳 pH 和缓冲液后，将不同的辅料添加到蛋白质溶液中。 如果辅料提高 Tm，则蛋白质的天然形式在有该辅料时比没有时更稳定。
在白介素-1 受体 IL-1R 的液体制剂研发过程中使用了辅料筛选[5]。 IL-1R 有两个主跃迁，一个在 Tm 接近 48°C 时，另一个是接近 66°C 时。 选择 Tm 温度较低时的跃迁筛选辅料。 该策略的目的是寻找可提高低温跃迁 Tm 的辅料，这指示天然蛋白质稳定性有积极改变。 筛选了 23 种辅料（表 2）。
表 2：添加到白介素-1 受体的辅料筛选
辅料 | 在缓冲液中的浓度 (g/ml) | 摩尔比 [Ms/Mp]* | Tm (°C) |
对照组† | 0.00 | – | 48.1 |
抗坏血酸 | 0.05 | 2037 | 36.7 |
糖 | |||
甘露醇 | 0.0517 | 2037 | 46.7 |
乳糖 | 0.0972 | 2137 | 49.7 |
蔗糖 | 0.0972 | 2037 | 49.7 |
葡萄糖 | 0.0512 | 2037 | 49.6 |
聚合物 | |||
PVP (MW 10 000) | 0.01 | 7 | 48.9 |
PVP (MW 300) | 0.0003 | 7 | 49.4 |
PVP (MW 1000) | 0.001 | 7 | 49.1 |
PVP (MW 3350) | 0.00335 | 7 | 48.7 |
右旋糖酐 40 | 0.0392 | 7 | 48.0 |
多元醇 | |||
丙三醇 | 0.01 | 779 | 48.7 |
乙醇 | 0.0051 | 779 | 48.6 |
乙醇 | 0.05 | 7617 | 43.8 |
盐 | |||
NaCl | 0.00584 | 717 | 53.1 |
CaCl2 | 0.0111 | 717 | 41.1 |
氨基酸 | |||
甘氨酸 | 0.01 | 955 | 46.2 |
L-赖氨酸 | 0.01947 | 955 | 48.3 |
L-半胱氨酸 | 0.01614 | 955 | 51.3 |
L-丙氨酸 | 0.01187 | 955 | 46.2 |
L-精氨酸 | 0.0232 | 955 | 49.1 |
表面活性剂 | |||
Pluronic™ F68 | 0.0001 | 4 | 46.6 |
Tween™ 80 | 0.001 | 5 | 45.8 |
组合 | |||
葡萄糖/NaCl | 0.0512/0.00584 | 2037/717 | 52.2 |
*Ms = 辅料的摩尔数 / Mp = 蛋白质摩尔数 †对照组缓冲液是 20 mM 柠檬酸缓冲液，pH 6.0。 辅料添加到此缓冲液中。 表格由 Remmele、R.L. 等人提供[5]。 |
离子强度
调节缓冲液的离子强度，以确定是否可以通过添加盐提高 Tm。 对于 IL-1R，添加 100 mM NaCl 可产生最大程度的稳定化影响，在适度的离子强度下 Tm 从 48°C 变为 53°C。这种稳定化影响表明盐离子与蛋白质的带电基团有直接的相互作用[5]。 IL-1R 的 Tm 随着盐浓度增加而增加，甚至在 NaCl 为 1500 mM 这种远高于使所有带电部位饱和所需的浓度时也是如此（图 5）。 这些数据表明，盐离子影响水结构，而水结构也对蛋白质的构象稳定性有重要影响。 电荷间交互作用和水结构的改变都可以提高天然 IL-1R 结构的稳定性。
图 5：添加 NaCl 的 IL-1R Tm 图。 虚线显示的是 100 mM 浓度。 资料来自参考文献[5]。
防腐剂
当药物采用多剂量形式提供时，需要添加防腐剂预防微生物生长。 然而，这些防腐剂可能会减弱蛋白质的稳定性。 防腐剂对 IL-1R Tm 的影响也有人进行了研究[5]。 两个温度跃迁都向更低温度移动，表明防腐剂间甲酚、苯酚和苯甲醇会降低 IL-1R 的稳定性（表 3）。 DSC 数据确定了 IL-1R 在三种防腐剂中的稳定性顺序 — 苯酚产生的 Tm 最高，然后是间甲酚和苯甲醇。 通过尺寸排阻色谱 (SEC) 测定可知，DSC 稳定性数据也与 IL-1R 的聚合相关联。 Tm 越高，在 7 天和 60 天后观察到的聚合越少。
表 3：防腐剂对 IL-1R 的影响：Tm 和尺寸排阻色谱对比。
DSC | SEC | ||||||
7 天 | 60 天 | ||||||
Tm1 (°C) | Tm2 (°C) | Tm3 (°C) | 聚合 % | 天然 % | 聚合 % | 天然 % | |
对照组 | 50.8 | 53.7 | 66.3 | 0.66 | 98.93 | 1.50 | 97.54 |
0.065%苯酚 | 50.3 | 53.4 | 66.5 | 1.02 | 98.62 | 3.07 | 96.02 |
0.1%间甲酚 | 48.4 | 51. | 65.8 | 1.37 | 98.25 | 5.1 | 93.92 |
0.9%苯甲醇 | 45.2 | 48.5 | 63.6 | 2.93 | 96.92 | 16.46 | 83.09 |
对照组溶液：20 mM 柠檬酸钠缓冲液，pH 6.0，100 mM NaCl。 对于尺寸排阻色谱 (SEC)，在进行色谱分析前 IL-1R 在 37°C 环境中根据规定存放一定时间。 Agg % = 聚合百分比，通过在 SEC 后积分高分子量蛋白质峰测定；天然 % = 天然 IL-1R 百分比，通过在 SEC 后积分主蛋白质峰测定。 资料来自参考文献[5]。 |
根据 Tm 筛选得出的最佳候选制剂在之后通过加速稳定性研究进行评估。 在不同制剂中制备蛋白质，然后在 37°C 环境中储存。 在加速稳定性研究期间通过定期进行尺寸排阻色谱分析确定聚合量，并使用 SDS-PAGE 分析蛋白质以确定是否发生蛋白质水解。
最后，必须对最佳候选制剂进行实时稳定性研究，以确定蛋白质的保质期。 在整个研究过程中进行生物鉴定和分析试验，确保蛋白质具有活性和功效。
DSC 在制剂研发期间用作评估蛋白质稳定性的筛选工具已有很多年的历史，且与Malvern MicroCal VP-DSC 相比，使用自动化的 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC可以更快地进行筛选，同时可提高通量（表 1）。 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC已用于确定蛋白质在不同 pH 和辅料条件下的 Tm，且 Tm 的变化与 SEC 数据相一致，支持将 DSC 作为稳定性筛选工具[17]。
总结
DSC 数据对于预测蛋白质在溶液中的稳定性非常有用。 Tm 指示热稳定性，而不同制剂中的 Tm 测定是低温条件下对聚合及其他不可逆变化的敏感性的近似测量。 已选择具有最佳热稳定性的制剂用于进一步的稳定性、保质期和运输研究。 使用 DSC 可节省制剂研发中的时间和资金，且全自动系统可提高此药物研发关键领域的效率和生产率。
参考文献：
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