【培养原理】
1．DC培养用细胞因子：
1.1 GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)
GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。
GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
1.2 IL-4 (白细胞介素-4)
IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表达CD14。
1.3 TNF-α (肿瘤坏死因子-α)
TNF-α可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC
II类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80,
CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature
DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。
2. CIK培养用细胞因子和抗体（同上）
【细胞制备】
1．外周血单个核细胞的采集
1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80-100mL；
1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的 PBMC，细胞数量需达到1-3x108。
2．(可选步骤) 肿瘤抗原的制备
用于负载 DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
用TSA或
TAA负载的DC具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全细胞抗原负载DC可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
2.1手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
2.2无菌生理盐水洗3次；
2.3用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
2.4 200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
2.5用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
2.6将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。
反复 3-5 次；
注：也可以-80℃/37℃ 反复冻融3-5次。
2.7将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
2.8收取上清，0.22μm 滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
2.9 -80oC保存备用。
3. CIK 细胞的培养及鉴定
3.1 步骤1中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
3.2 37℃，5%CO2 培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；
3.3 收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至 1-2 x 106/ml；
3.4 加入1,000 U/ml 的重组人IFN-γ培养；
3.5 24h 后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；
注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1。
3.6 每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
3.7 在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x109个以上。
3.8 CIK细胞质控：
3.8.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
3.8.2 用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。
4．DC 细胞的培养及鉴定
4.1 步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是 CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
4.2 每3d半量换液一次，并补足细胞因子；
4.3 (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50μg/ml，对DC进行抗原负载；
注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。
4.4在培养的第6d，加入重组人TNF-γ(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；
4.5在培养的第7d或第8d，收获DC细胞，其数量应达到1×106个以上；
4.6 DC的质检：
4.6.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
4.6.2 流式细胞仪检测DC细胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表达，以确定DC 是否成熟。
5. DC-CIK 细胞的制备和质检
5.1 收集步骤4和步骤3中所获得的DC细胞和CIK细胞，按1:10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2 (300 U/ml)；
5.2 每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)；
5.3 在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
5.4 DC-CIK细胞的质检：
5.4.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
5.4.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
5.4.3
细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1x104个，终体积为200μl，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)
试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
5.4.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
【步骤简图】
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