1、  低速离心数秒，并且按照荧光PCR仪的使用说明放置好您的PCR管/条/板；

2、  从下列表中选择最合适的实验反应条件，按照荧光PCR仪的使用说明设置好PCR反应条件：

*注意罗氏LightCycler 480 ®用户：请调整升温速率为1℃/秒。更多关于其他所需的改变和熔融曲线设置的信息请参阅仪器安装指南。

3、下列仪器使用三个步骤的循环程序：

[1]95℃ 5分钟的步骤是为了激活热启动DNA聚合酶。

[2]检测并记录荧光染料荧光信号在每个周期的延伸结束时。

[3]不同的仪器需要检测荧光信号的时间长短不同，请根据您的仪器选择适当的延伸时间。

反应条件示例：95℃ 5分钟→95℃ 15秒→60℃ 30秒（读板）→溶解曲线分析；

40个循环

注：以上反应条件是应用BioTNT 染料法premix（货号：A2010A0112），在ABI stepone plus上的反应条件。请注意，第一步95℃ 5分钟 是BioTNT premix的hot start的特点，如使用其他公司的premix，请调整这一步的反应时间。

十、实验结果判断:

  i.阳性对照(或者客户的阳性模板)的内参基因的熔解曲线呈单峰，其Tm与引物说明书上的产物Tm相近；扩增曲线呈S型； 双重复重复良好（Ct值相差不超过1），说明加样误差和仪器误差比较小，可用；如果 CT相差超过1.5，该数据不可用，需要重新检测；

  ii.阴性孔Ct＞33，熔解曲线在目的产物或内参产物峰处无明显特异性产物峰出现，说明实验体系无污染，数据可信；

 iii.内参实验的CT值在15-25之间，可根据文献来确定内参基因CT应该在的区域，来进行数据判断，抽提和逆转录的可靠性；

iv.其他情况请参考实验疑难分析与解答或咨询公司技术人员。

十一：内参基因的选择：

1、对照组和实验组的内参基因，尽量少受实验干预的影响；可以进行多个内参基因的比较，选择较少受实验干预影响的内参基因；

2、请选择与目的基因CT比较接近的内参基因，来作为实验的内参基因，进行均一化处理。

十二、Trouble shooting