转基因大米中Bt基因的检测方法

2014 年 7 月，央视日前报道了湖南、湖北、安徽、福建等4省存在转基因大米的新闻，引发社会极大关注。记者在武汉市一家大型超市，随机购买5种大米。经检测后发现，这 5 种大米中，有 3 种含转基因成分：Bt63。Bt63 是一种抗虫害的基因，它是苏云金芽孢杆菌基因中的杀虫晶体蛋白基因，可以有效防止鳞翅目等多种有害昆虫。

近年来转基因事件层出不穷，时有耳闻。那什么是转基因呢？转基因技术是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因或者人工合成指定序列的DNA 片段，将该基因片段转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。农作物转基因通常是为了获得抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等特性。

中国目前并未批准转基因水稻的商业化生产。欧盟委员会决议：中国大米产品必须凭不含转基因Bt63大米成分的证书才能进入欧盟市场。其解释为：“转基因作物只有经过全面科学的评估和批准，才能允许投放入欧洲市场。”这一决定目的在于防止未被批准的转基因Bt63大米被欧洲消费者购买和食用。可见大米中Bt基因的鉴别十分关键。检测大米中Bt基因有较多方法，RephiLe 以《农业部 953 号公告-6-2007_转基因植物及其产品成分检测抗虫转 Bt 基因水稻定性 PCR 方法》 为基础，推出大米 Bt 基因检测解决方案，具体如下：

一、实验原理

根据转基因大米特异性序列设计引物，对试样进行 PCR 扩增。对 PCR 结     果进行检测，确定是否含有转基因片段。

二、仪器和试剂

PCR 仪 MyCycler (biorad,USA)

台式微量冷冻离心机 Microfuge 22R （BeckmanCounter ,USA）

凝胶成像系统 Gel DocTM XR（biorad,USA）

紫外检测仪 NanoDrop1000 (eppendorf,German)

核酸电泳仪 EPS100 (上海天能)

超纯水仪 Direct-Pure UP（RephiLe）

恒温水浴 HH.S.21.8 (上海跃进医疗器械厂)

三、试验方法

1、试样预处理

将大米粉碎，制成待测样品。

2、基因组提取

使用 Axygen 基因组 DNA 小量试剂盒，按照其所述方法提取，UV 检测含量。

3、引物设计

4、PCR 条件

反应体系：使用 DBI 2xTaq PCR Master Mix，按照说明，加入模板及引物。

反应条件：第一阶段 95 ℃ 变性 5 min；第二阶段 35 次循环：94 ℃ 变性 1 min，56 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s）；第三阶段 72 ℃ 延伸 7 min。

5、核酸检测

对 PCR 产物进行凝胶电泳。SPS 扩增产物大小 277 bp，Bt 扩增产物大小 301 bp。

6、结果确认

采用含 Bt 基因的质粒作为阳性对照，确认不含 Bt 基因的水稻做印性对照。阳性对照 SPS与 Bt 基因都扩增出来，阴性对照只扩增出 SPS 基因

待测样本如扩增出 SPS 基因，表明含水稻成份。

如扩增出 SPS 基因和 Bt 基因，表明含转基因水稻成份。

普通 PCR 实验只能确定样本中是否含转基因成份。需要确认转基因水稻含量可以通过Realtime PCR 实验。

PCR 实验对于实验用水的要求非常高，水中的污染物会造成不同的损害：金属离子特别是 Mg 等会影响 Taq 酶的活性。有机物特别是腐殖酸和棕黄酸，会与 DNA 缔合或者干扰酶，并影响荧光信号；DNA 酶会降解 DNA。细菌在代谢的过程中会释放离子和有机物，产生各种干扰。因此，PCR 实验中必须使用无离子，无有机物，无细菌的超纯水。

为保证 PCR 实验的准确性，生命科学实验室都会配备高质量的超纯水仪来进行实验，例如，中国科学院上海营养所、湖南农业大学袁隆平实验室等国内知名生物实验室使用的是RephiLe Direct-Pure UP 超纯水仪。Direct-Pure UP 超纯水仪以自来水为进水，生产 RO 纯水和超纯水。它采用两组大容量的双管纯化柱，有效去除水中的痕量金属离子，产水电阻率可达到 18.2 MΩ•cm。内部超纯水定时循环，配合双波长紫外灯可以降低水中的有机物水平至 5 ppb 以下。终端特别配置超滤除热原柱，可以有效去除细菌和热原等生物大分子物质。Direct-Pure UP 超纯水仪适合包含 PCR 在内的分子生物学实验使用。RO 纯水可以用于洗涤实验器皿，超纯水可以配置电泳 Buffer，做空白对照等。

转基因是一门严肃的科学，民众对于转基因食物的安全性信任度非常低，对于转基因棉花之类的非食用作物则相对较高。现阶段所有的实验数据都不能证明转基因食物对于食用者的健康造成影响。当然，转基因问世时间也不长，其实验样本的数量还较低，长效结果还无法验证。生命科学是一门非常广阔的科学，可能穷尽一生时间也无法彻底研究完。我们支持转基因实验，这对缓解日益增长的粮食需求有很大帮助；但是，商业化转基因食品需要由民众自由选择，转基因食品必须带有明确的标识，每个人都有权利选择。随着转基因研究的不断深入，终有一日，安全的转基因食物会走入千家万户，为世界的发展做出贡献。