免疫组化专题：流式细胞仪检测技术实验（一）

淋巴细胞 外周血的白细胞

FACS缓冲液 PBS 叠氮钠溶液 仪器缓冲液 FACS清洁液 FACS洗净液

流式细胞仪

一、细胞和试剂的准备

1.  细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞。

2.  荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体。

3.  封闭抗体：抗Fc受体抗体

4.  FACS缓冲液：

1×PBS  950 ml

FCS  40 ml

10%叠氮钠溶液  10 ml

5.  仪器缓冲液（FACS-flow）：仪器厂家提供

6.  FACS清洁液（FACS clean ）和FACS洗净液（FACS rinse）：仪器厂家提供。

二、操作步骤
 

1.  单细胞悬液的制备：将1×10⁵~1×10⁷的细胞放入1.5 m l离心管中3000 r/min 离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100 μl 悬浮细胞。

2.  封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5 μl（0.5 mg/ml），水浴3分钟。

3.  细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1 μl（0.5 mg/ml），水浴30分钟。

4.  洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350 μl，轻轻混匀，3000 r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。

5.  上样前处理：取100 μl 仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。

三、仪器的操作

以FACSCaliburTM（BD Biosciences）仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuest softwere）。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。

1.使用前的准备

（1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源。

（2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用后清洗干净。

（3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。

（4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。

2.使用中的操作

（1）计算机部分—使用CELLQuest程序系统软件：

①设定所要检测细胞的数量：一般设10 000~20 000个细胞。

②命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。

③打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。

④将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测。