ClonePix技术快速筛选和开发高表达GPCR的哺乳细胞系（二）

ClonePix2系统成像和挑取表达GPCR(M1)的细胞克隆   ClonePix2 成像和挑取阳性（CHO-M1）和阴性（CHO-K1）细胞。明场成像识别每个克隆的位置和形态，荧光成像识别高表达的M1。对PE标记的抗体，使用Cy5通道曝光6,000ms。 无论是直接标记方法还是双抗体方法，根据ClonePix2的记录，CHO-M1阳性细胞产生大范围的荧光信号。图1显示了M1 GPCR不同程度的表达。正如预期，亲本CHO-K1细胞没有产生荧光信号。 细胞基于形态和荧光强度被分组。挑取克隆的形态基于大小、形状和克隆之间的邻近度。形态学理想的克隆根据内部荧光强度排名，并设门分为四个荧光组：高、中、CHO-K1阴性和ungated（图2）.  CHO-K1阴性组被定义为背景荧光信号。所有的克隆识别对应于阴性对照孔。Ungated克隆是指低荧光信号但高于背景荧光信号的克隆。 直接标记抗体和双抗体的方法（图3）显示了阳性样品（表达M1）的荧光信号和无荧光信号的亲本细胞系（图4）。正如预期，由于一抗和二抗结合，双抗体的方法在PE通道产生了更高的背景信号。然而ClonePix2在明场检测细胞，然后再看细胞克隆内的荧光信号。在PE通道中识别到但在明场识别不到的物体不被当做是克隆。因此，ClonePix2系统好处是具有从背景信号中区分真实克隆的能力。    ClonePix2系统挑取的克隆CHO-M1储存到含200μL Ham’s F12  media+10%FBS+G418的96孔Greiner板，而CHO-K1克隆储存到同样的微孔板但不包括G418。这些96孔板在CloneSelect  Imager系统中成像确认细胞的转移和生长（图5）。细胞培养一周后再使用CloneSelect  Imager分析确保细胞已经增殖（图5和6）。细胞随后转移到384孔板，用FLIPR Tetra系统和钙6试剂进行功能确认。       FLIPR Tetra系统验证ClonePix2挑取细胞的M1 GPCR表达  细胞准备 ClonePix2系统挑取的细胞种到384孔，每孔25μL培养基，5,000个细胞，37℃,95%湿度和5%CO₂过夜培养。这些细胞分选为四个组：高、中、低和no M1表达。   加入钙敏感荧光染料 从培养箱中取出细胞培养板，室温平衡。25μL的FLIPR Calcium 6 染料直接加入含培养基的细胞板。这些板孔中加入2.5Mm的丙磺舒阻止有机离子转运，37℃孵育2小时。室温保持直到荧光读数。   FLIPR Tetra 荧光成像读板仪 孵育和室温平衡后，放一块板到FLIPR系统中，FLIPR系统ICCD相机捕获荧光钙信号，成像参数如下： 曝光（sec）          0.53 激发LED(nm)         470-495 发射滤光片(nm)       515-575 LED 强度(%)          80%   FLIPR 钙6 试剂盒 每秒荧光读数，分别在加Carbachol之前读10个点，加40nm的Carbachol之后读60点。Carbachol的起始浓度是终浓度的5倍。Carbachol的加入体积是12.5μL ，分液速度是20μL/sec.   FLIPR Calcium 6试剂盒验证挑好的CHO-M1和CHO-K1细胞克隆 膜结合G蛋白偶联毒草碱受体表达水平用标记PE的抗M1最新传代细胞和初始的CHO-M1细胞，预期的结果是初始的CHO-M1细胞M1 GPCR的表达水平将大大低于最新传代的细胞。亲本的CHO-K1细胞作为阴性对照。 受配体GPCR的激活，受体构象的改变触发胞内G蛋白的激活。活化的G蛋白具有诱导胞内的不同信使包括钙信使的潜能。   ClonePix2系统挑取的不同组细胞用FLIPR  Tetra系统来评价功能活性。在40nM的Carbachol条件下，钙敏感荧光染料（FLIPR Calcium 6 Assays kit,  Molecular Devices）用来评估胞浆中钙离子随着激活的G蛋白偶联IP3敏感通路的变化而变化的可行性研究。历史数据表明，40nM  Carbachol 是 EC80的浓度。    在高荧光的CHO-M1细胞克隆中，相对背景，Carbachol产生了增加4倍的荧光读数（图7A）。在混合中和低荧光的CHO-M1细胞克隆中，Carbachol分别产生了4倍到2倍的荧光读数增加（图7B）。最后阴性对照的CHO-K1细胞，Carbachol没有引起荧光读数的任何变化（图7C）。由于每组细胞，除了中和低表达荧光的混合细胞，是分别种在不同的384孔板中，在加入40nM的Carbachol之前，每孔基线荧光强度的变化都进行了背景荧光的均一化。   这些结果支持了在膜结合G蛋白偶联毒草碱受体表达水平和功能活性之间的正相关性。缺乏荧光信号的CHO-K1细胞阴性对照进一步确认了ClonePix2系统能准确区分表面表达M1 GPCR 的细胞和表面没有表达M1 GPCR的细胞。    总结  为了满足高通量筛选和选择性需求分析，GPCR转染细胞系是细胞功能试验强有力、独特和规范的研究平台。本文的结论是初步的研究揭示了ClonePix2系统能可靠地检测GPCR不同表达水平的细胞克隆。而且，荧光强度和FLIPR  Tetra系统测定的GPCR介导的胞浆内钙离子水平的变化呈现正关联，这些钙离子的变化恰恰膜结合G蛋白偶联毒草碱受体M1表达差异导致的。  ClonePix2系统能够有效用于检测和挑取不同GPCR表达水平的细胞克隆，因此为需要高质量GPCR蛋白的各种应用提供了唯一的资源，这些应用包括（1）使用高表达天然表位的抗原生产相应的抗体；（2）表达GPCRs困难的特殊GPCR家族的细胞功能分析。