差示反转录PCR也称为mRNA差异显示技术，它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品，该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。
| 实验方法原理 | 几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P.Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | 丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺 SuperscriptTMⅡ试剂 柠檬酸钠 Taq DNA聚合酶 dNTPs 十二烷基肌氨酸钠 巯基乙醇 RNAimage试剂盒 异硫氰酸胍 焦碳酸二乙酯 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、实验材料
1. 红豆杉细胞
未经MJ诱导处理的A和经MJ诱导处理的B红豆杉细胞。
2. 寡核苷酸引物
（1）3’锚定引物： ①H-T11A(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’ ②H-T11C(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’ ③H-T11G(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’
（2）5’ 随机引物：
Kit引物： ①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTGATTGCC-3’ ②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCGACTGT-3’ ③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’ ④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTCTCAACG-3’ ⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’ ⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGCACCAT-3’ ⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTAACGAGG-3’ ⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTTACCGC-3 |
mRNA差异显示法
荧光标记法
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