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改善记忆作用检验方法(一)

2020.6.22
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

1动物实验 
1.1跳台实验 
1.1.1原理 
反应箱底铺有通36v电的铜栅,动物受到电击,其正常反应是跳上箱内绝缘的平台以避免伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击又迅速跳回平台,如此训练5min,并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数,以此作为学习成绩。24h或48h重作测验,此即记忆保持测验。记录受电击的动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数。停止训练5天后(也可以在训练后的一周、两周或其它时间点)进行记忆消退实验。 
1.1.2仪器与试剂 
跳台仪:该装置为10×10×60cm3的被动回避条件反射箱,用黑色塑料板分隔成5间。底面铺以铜栅,间距为0.5cm,可以通电,电压强度由一变压器控制。每间左后角置一高和直径均为4.5cm的绝缘平台。 
试剂:樟柳碱、环已酰亚胺、乙醇。 
1.1.3实验方法 
1.1.3.1实验动物 断乳鼠,体重10g左右;或成年鼠,体重18-22g用于改善老年人记忆的产品必须采用成年鼠。雌雄均可,单一性别不少于10只(最后有效数据)。推荐使用近交系小鼠。 
1.1.3.2剂量设计和分组 
共设高、中、低、对照四个组,根据推荐的人体每日每公斤体重摄入量,扩大10倍作为其中一个剂量组,根据受试样品的具体情况另设两个剂量组。经口给样。原则上连续给样30天,也可根据实验需要自行设定给样期限。 
1.1.3.3实验方法及步骤 
1.1.3.3.1受试样品对正常小鼠记忆的影响 
末次给样后次日(或一次给样后1h)开始训练。将动物放入反应箱内(台上、台下)适应环境3min,然后将动物放置反应箱内的铜栅上,立即通以36v的交流电。动物受到电击,其正常反应是跳回平台(绝缘体),以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击又迅速跳回平台上。训练一次后,将动物放在反应箱内的平台上,记录5min内各鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期,以此作为学习成绩(记忆获得)。24或48h后进行重测验,将小鼠放在平台上,记录各鼠第一次跳下平台的潜伏期、各鼠3min内电击次数和受电击的动物数总数,同时计算出现错误反应的动物的百分率(受电击的动物数占该组动物总数的百分率)(记忆巩固)。停止训练5天后(包括第5天)可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验(记忆再现,方法同重测验)。 
1.1.3.3.2受试样品对记忆障碍模型小鼠的影响 
1.1.3.3.2.1模型制造 
记忆获得障碍模型制造:训练前10min腹腔注射樟柳碱或东莨菪碱5mg/kg体重; 
记忆巩固障碍模型制造:训练前10min腹腔注射环已酰亚胺120mg/kg体重; 
记忆再现障碍模型制造:重测验前30min灌胃30%的乙醇0.1mL/10g体重; 
1.1.3.3.2.2记忆测试的操作方法:同1.1.3.3.1 
1.1.4数据处理及结果判定 
潜伏期结果为计量资料,可用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值 错误次数和3min内跳下平台的动物均为记数资料,可用X2检验,四格表总例数小于40,或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时,应改用确切概率法。 
若受试样品组与对照组比较,潜伏期明显延长,错误次数或跳下平台的动物明显少于对照组,差异有显著性,以上三项指标中,任一阶段(记忆获得、记忆巩固和记忆再现)的任一项指标阳性,均可判定该项实验阳性。 
1.1.5注意事项 
1.1.5.1动物在24h内有其活动周期,不同时相处于不同的觉醒水平,故每次实验应选择同一时间(上午8-12点或下午1-4点),前后2天的实验要在同一时间内完成。 
1.1.5.2实验应在隔音,光强度和温、湿度适宜且保持一致的行为实验室进行。 
1.1.5.3推荐使用纯系动物,实验前数天将动物移至实验室以适应周围环境。 
1.1.5.4实验者必须每天与动物接触,如:喂水、喂食和抚摸动物。 
1.1.5.5减少非特异性干扰,如情绪、注意、动机、觉醒、运动活动水平、应激和内分泌等因素。 
1.1.5.6考虑动物种属差异。 

1.2避暗法 
1.2.1原理 
利用小鼠嗜暗的习性设计一个装置,一半是暗室,一半是明室,中间有一小洞相连。暗室底部铺有通电的铜栅,并与一计时器相连,计时器可自动记录潜伏期的时间。小鼠进入暗室即受到电击,计时自动停止。 
1.2.2仪器和试剂 
避暗仪:该装置分明暗两室。明室大小为12cm×4.5cm,其上方约20cm处悬一40w钨灯丝。暗室较大,大小17cm×4.5cm,两室之间有一直径约3cm的圆洞。两室底部均铺以铜栅。暗室底部中间位置的铜栅可以通电,电击强度可在一旋钮上任意选择。一般40v电压。暗室与一计时器相连,计时器可自动记录潜伏期的时间。 
试剂:樟柳碱、环已酰亚胺、乙醇。 
1.2.3实验方法 
1.2.3.1实验动物 同1.1.3.1 
1.2.3.2剂量设计和分组 同1.1.3.2 
1.2.3.3实验方法及步骤 
1.2.3.3.1受试样品对正常小鼠记忆的影响 
末次给样后次日(或一次给样后1h)开始训练。实验时将小鼠面部背向洞口放入明室,同时启动计时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击,计时器自动停止,取出小鼠,记录每鼠从放入明室至进入暗室遭电击所需的时间,此即潜伏期,训练5min,并记录5min内的电击次数(记忆获得)。24h或48h后重作测验,记录每只动物进入暗室的潜伏期和5min内的电击次数,并计算5min内进入暗室(错误反应)的动物百分率(记忆巩固)。停止训练5天后可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验(记忆再现)。 
1.2.3.3.2受试样品对记忆障碍模型小鼠的影响: 
1.2.3.3.2.1模型制造:方法同1.1.3.3.2.1 
1.2.3.3.2.2操作方法:同1.2.3.3.1 
1.2.4数据处理及结果判定 
潜伏期时间为计量资料,可用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值 5min内进入暗室的次数和5min内进入暗室的动物数均为计数资料,可用X2检验,四格表总例数小于40,或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时,应改用确切概率法。 
若受试样品组小鼠进入暗室的潜伏期明显长于对照组,5min内进入暗室的错误次数或5min内进入暗室的动物数少于对照组,且差异有显著性,以上三项指标中任一阶段(记忆获得、记忆巩固和记忆再现)的任一项指标阳性,均可判定该项实验阳性。 
1.2.5注意事项:同1.1.5

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