胰蛋白酶消解的兼容性
胰蛋白酶是最常见的蛋白水解酶，可用于肽图分析和蛋白组学的应用。我们研究了在添加 RapiGest SF 的情况下胰蛋白酶的活性作用，并与文献中最常见的变性剂的作用做了对比。本检测基于胰蛋白酶诱导 N-α- 苯甲酰 -L- 精氨酸乙基乙酯（ BAEE ）在 50 mM 重碳酸胺（ pH 7.9 ）中的室温水解。胰蛋白酶活性的变化通过 UV 253 nm 下测量 BAEE 水解率进行计算。在选择的变性溶液中，胰蛋白酶活性与对照样品进行对比（非变性剂）。结果见于表 1 。
表 1 中的数据说明低浓度下（ 0.1% ） RapiGest SF 不抑制胰蛋白酶的活性。这与结构上类似的表面活性剂 SDS 不同， SDS 是很强的变性剂，可会使胰蛋白酶失活。尿素、乙腈或盐酸胍也是胰蛋白酶消化的变性剂。但是乙腈是强洗脱剂会干扰消解样品进行反相 LC 分析。正如我们所知，尿素可使蛋白共价修饰，盐酸胍也和 SDS 一样可以使酶失活。
本实验说明蛋白酶的活性受到蛋白溶液中所用变性剂的影响。 RapiGest SF 在从低到高的浓度下均不改变酶活性，因此，最佳的蛋白消解条件是无需过量酶即可达到酶解的结果。
快速蛋白消解
对蛋白酶解存在抗性的蛋白使用 RapiGest SF 试剂，可在数分钟内消解完全。完全消解球蛋白、马肌红蛋白只需要 5 分钟内即可完成。该试剂辅助的消解结果与对照见图 3 。由于肌红蛋白是 球蛋白 ，众所周知，若没有表面活性剂将难以消解。在对照反应中，与胰蛋白酶孵育 9 小时后只有少量的蛋白可以消化。使用了 RapiGest SF 试剂，总体的消解的效率显著提升。
在蛋白药物肽图中的序列覆盖范围更大
RapiGest SF 在蛋白组学的样品前处理中广泛使用，是有效的蛋白溶解变性剂。最近越来越多的生物制药实验室在肽图分析中采用了 RapiGest SF 。一些发表的论文记录了使用 RapiGest SF 进行蛋白药物消解的优势。 4,5 经报导的 RapiGest SF 浓度范围为 0.05 -1% ，取决于蛋白疏水性与浓度。
我们发现浓度范围为 0.05 -1% 的 RapiGest SF 足以使各种大小的蛋白变性，高浓度 RapiGest SF 适合全细胞蛋白提取的实验。
单抗（ mAbs ）肽图分析一直以来都因为难以消解这些大疏水蛋白而难以实现。肽图分析的目的是确认蛋白序列并发现所有存在后翻译修饰（ PTMs ）的蛋白。图 4 举例说明了 RapiGest SF 辅助的人单抗消解的实例。样品制备与分析的参数以 UPLC ® 和四级杆 Tof 质谱分析的参数已列表作为指导。
人化单抗 IgG 多肽图谱
蛋白序列覆盖率 = 98%
图 4 显示实验中总序列覆盖率为 98% 。数据分析通过 BiopharmaLynx™ v.1.2 软件得到。高序列覆盖率（ 98% ）说明单抗完全消解。 LC/MS 分析中没有发现错误酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。剩下的 2% 未确认的序列为少数二个氨基酸的肽或单个氨基酸（ R 或 K ），而无法在反相柱上保留。
样品制备
人单抗样品（ 10 μL, 21 mg/mL ）在含有 0.1% （ w/v ） RapiGest SF 的 50 μL 50 mM 重碳酸铵中溶解。将 2 μL 0.1 M 的二流苏糖醇（ DTT ）加入样品，样品在 50 °C 加热 30 分钟，加入 4 μL 0.1 M 的碘代乙酰胺，在样品冷却至室温后样品在黑暗中静至 40 分钟。
样品中加入 8 μg 胰蛋白酶（胰蛋白酶浓度 = 1 μg/μL ），样品在 37 °C 孵育过夜。消解样品与 1% 甲酸与 10% 乙腈混合（ 1 ： 1 ， v ： v ）。用 Milli-Q 水（ Millipore ）稀释至 5 pmol/μL 后进行 LC/MS 分析。
LC 条件
LC 系统： 沃特世 ACQUITY UPLC ® 系统
色谱柱： ACQUITY UPLC BEH 300 C 18 肽分离专用柱 , 2.1 x 100mm （ P/N = 186003686 ）
柱温： 40 °C
样品进样： 2 μL （ 10 pmol ）
溶液 A ： 0.1% 甲酸水溶液
溶液 B ： 0.1% 甲酸乙腈溶液
流速： 200 μL/min
梯度： 0-2 分钟 :2%B
2 – 92 分钟： 2 -35% B
92 -102 分钟： 35 - 50% B
102.1 -105 分钟 ： 90% B
105.1-110 分钟： 2% B
MS 条件
MS 系统： 沃特世 SYNAPT™ MS （ V 型）
毛细管电压： 3.2 kV
源温度 . ： 120 °C
去溶剂温度 . ： 350 °C
去溶剂气： 700 L /hr
MS 扫描速率： 1 秒 / 次
锁定质量通道 ： 100 fmol/μL Glu-Fib 多肽（ m/z 785.8426, z = 2 ），流速 20 μL/min
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