密度梯度离心基础知识（四）

从上面公式可以看出，要使曲线变陡：
a：降低β°
b：提高转速
c：加大离心半径
d：增大初始密度
以同等转速离心，甩平转头的 r较大，在同等初始密度条件下，甩平转头的密度梯度曲线比垂直管转头、近垂直转头或固定角式转头都要陡一些。（参见下图）

CSCL初始密度为 1.72g/cm3时的自形成梯度曲线

九十年代以前生物大分子离心分离实验多数是利用甩平转头，转速在60,000rpm以下，某些实验一次要离心数十小时，使用的CSCL也较多（分析纯，价格高，且不能反复使用）离心分离成本昂贵（如80年代初期，质粒DNA分离，CSCL初使密度为1.71g/cm³，33,000rpm， 20℃甩平转头离心72小时，一次离心就用去了驱动部1.4亿转的寿命，而当时的超速离心机驱动部的保用寿命才100亿转，虽然由于CSCL在离心后梯度曲线较陡而获得了很纯的质粒 DNA和染色体 DNA，但成本实在是太高了）。九十年代开始使用近垂直管（或称小角度）转头，在 CSCL梯度中加入 E.B.和 Triton x-100，初始密度 1.55g/cm³、78,000rpm，20℃离心4小时（用去驱动部寿命0.187亿转）或用垂直管转头，同样的梯度 100,000rpm，20℃2小时（用去驱动部寿命0.12亿转都获得了满意的结果。（文献 5）
●梯度的密度范围：
在不同距离处（r₂，r₁）密度差可以用下面公式表示：
从上式可以看出（ρ₂-ρ₁）值不仅和转速的平方而且和距离的平方差成正比。
●转头选择对梯度曲线斜率与梯度范围时影响：从前面的曲线图可以看出对不同转头，梯度曲线的差异：水平转头离心时和复原（离心完成）后对于梯度来说，离心管中液面至管底距离保持不变。对固定角式，小角度转头及垂直管转头，离心头沉降距离很短，而在离心后复原时这项距离明显拉长了，也就是说梯度曲线变得平缓了，这种距离的延伸有利于离心分辨率的提高。因此垂直管转头比NVT（近垂直管）转头，NVT转头比角式转头的距离延伸更大，分辨率也就更高。但与此相反，纯样品带的宽度都是甩平转头最窄，垂直管转头最宽。
●梯度中的最大和最小密度：
计算前，首先要找到等密度点的位置。
等密度点：离心后密度与离心开始时初始密度相等的点。
对于甩平转头：设等密度点为 rc

式中：r_t梯度表面与旋转中心距离
         r_b离心管底与旋转中心距离
该公式可用于估算离心结束时（转头刚开始减速时）角式转头及垂直管转头的 rc位置。设梯度液初始密度（均匀）为ρ i，在求得 r_c后梯度中最大密度与最小密度可用下式计算：

如果已经设计好密度变化范围就可以计算所需要的离心转速：

 
●计算实例：
DNA分离，CSCL梯度，初始密度 1.70g/cm³，根据离心要求，理想的最大密度为ρ_b=1.75g/cm³，最小密度为ρ_t=1.65g/cm³
用某甩平转头最高转速55,000rpm，r_b=12cm，r_t=6.7cm则 N=45,500rpm，
校核：由于密度＞1.2 g/cm³按规定这个转头的最高转速不能超过：

46,200rpm＞45,500rpm所以设计成立。
●离心时间计算：
计算例题中离心所需要的时间：
已知 r平均=9.35cm，样品 S_20.w=15

●讨论必须注意不能使 CSCL在离心管底部最大密度超过 1.9 g/cm³， 20℃，否则CSCL将可能析出结晶，而CSCL的结晶密度为4 g/cm³，很可能在结晶的局部损坏塑料离心管，从而造成CSCL泄漏而进一步腐蚀转头，（特别是铝合金转头）而造成转头在离心中炸裂的严重事故。为安全起见，重金属的梯度实验不要在铝合金转头或甩平转头中的铝合金吊桶中做。
（4）预形成梯度
●不连续（阶梯型）梯度：
分层铺设不连续梯度，样品铺在梯度液之上，离心时不同组份越过小于本身浮密度时梯度层次而最后到达密度大于样品浮密度的梯度界面之前形成纯样品区带。一般设置三至五个层次。
●连续梯度：
根据被分离样品的性质设计线性、凸指数、凹指数或凹凸复合指数曲线梯度。样品一般铺在梯度液上部离心分离，要注意的是某些梯度材料（如重金属盐）预形成梯度在离心过程中由于离心力和浓度扩散的复合作用而可能改变形状。我们也可以用离心来制备预形成梯度，如果形成的梯度曲线（近直线型）中点的密度和初始密度相同则梯度的稳定时间（对 CSCL）
T=0.3 (r_b −r_t )² （小时）
当然这是用于估计形成不同 CSCL梯度曲线所需要的时间的经验公式。它可用以实际离心操作。
（5）为了使实验人员对不同生物体在不同梯度材料中的浮密度有初步认识，下列图供参考图中：
a.在水或在 0.25M蔗糖液中的推定浮密度
b.在等密度蔗糖液中推定浮密度
c.在等密度 CS2SO4中推定浮密度
d.在等密度 CSCL中推定浮密度