一 摘要：
1．1 实验内容：
厌氧菌的分离、培养及鉴定；
1．2 目的：
1 掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。
了解厌氧菌菌鉴定的一般方法。
2 复习并巩固平时所学的微生物知识与技能。
3 培养独立思考、设计和动手实验的能力。
二 介绍：
厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。
专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，他们的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
厌氧菌的培养：
在培养厌氧菌时，最需要控制的是厌氧条件，在pH=7.0,O2的浓度与1atm的氧平衡时，O2——O2-反应的电位是0.81V，因此，在-0.33V时，O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。每升饱和了空气的水中含有1.48×10-55个O2。所以说，要保证厌氧菌培养时的低电位是很重要的。
厌氧菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术
因此他是世界上第一个分离纯化厌氧菌的人。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌种都不会干扰厌氧条件。
三 实验材料与设备：
3．1 分离与培养：
3．1．1菌种：待测样品；
3．1．2 培养基：改良的PRAS培养基(氮素自加）
[配方组成——NH4CL
1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4
0.2g,甲酸钠5g,乙酸钠5g,甲醇3.5ml,Ph值为7.0,蒸馏水1000ml,1%的树脂刃天青（还原指示剂）1ml,121摄氏度灭菌20min.使用前每5ml培养基加入1%Na2S（还原剂）和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液（抑制剂）各0.1ml]
3．1．3 试剂：冰块 Na2S NaHCO3
3．1．4 器材：高纯氮气 厌氧管 厌氧手套箱 注射器 恒温培养箱 铜柱除氧系统 定量加样器 厌氧罐 超声波破碎仪 酒精灯 冰块 水浴锅 记号笔 振荡器 等
3．2 菌种的鉴定：
3．2．1 菌种：待测菌
3．2．2 培养基；糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基（液体）；
3．2．3 试剂；乙醚 吲哚试剂 卢戈氏碘液；
3．2．4 器材：超净工作台 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌锅 接种环 移液管载玻片 显微镜 等
四、实验方法与步骤：
4．1分离与培养
4．1．1 铜柱系统除氧
铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2
和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。
4．1．2 预还原培养基及稀释液的制备
在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，于灭氧罐中灭菌备用。
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